1. RNA 용액의 흡광도 검출
280, 320, 230 및 260 nm에서의 흡광도는 각각 핵산, 배경(용액 탁도), 염 농도 및 단백질과 같은 유기물의 값을 나타냅니다.일반적으로 OD260/OD280(Ratio, R)만 봅니다.1.8~2.0일 때 RNA에 있는 단백질이나 다른 유기물의 오염은 용인될 수 있다고 생각하지만 흡광도를 검출하기 위한 완충액으로 Tris를 사용할 경우 R 값이 2보다 클 수 있음(일반적으로 <2.2이어야 함)에 유의해야 합니다.R<1.8일 때 용액 내 단백질 또는 기타 유기 물질의 오염이 더욱 명백해지며 필요에 따라 RNA의 운명을 결정할 수 있습니다.R>2.2이면 RNA가 단일 핵산으로 가수분해되었음을 의미합니다.
2.RNA의 전기영동 패턴
일반적으로 RNA 전기영동에는 denaturing gel을 사용하지만 RNA의 quality만을 검출하기 위한 경우에는 denaturing gel이 필요하지 않으며 일반적인 agarose gel을 사용할 수 있다.전기영동의 목적은 28S 및 18S 밴드의 무결성과 그 비율 또는 mRNA 스미어의 무결성을 감지하는 것입니다.일반적으로 28S와 18S 밴드가 밝고 선명하며 샤프한(밴드의 가장자리가 선명한 것을 의미) 28S의 밝기가 18S 밴드의 2배 이상인 경우 RNA의 품질이 좋은 것으로 간주합니다.
위의 두 가지 방법은 우리가 일반적으로 사용하는 두 가지 방법이지만, 이 두 가지 방법 중 어느 것도 RNA 용액에 잔류 RNase가 있는지 여부를 명확하게 알려줄 수는 없습니다.용액에 매우 적은 양의 RNase가 있으면 위의 방법으로는 검출하기 어렵지만 이후의 대부분의 효소 반응은 37도 이상에서 오랜 시간 동안 수행됩니다.이와 같이 RNA 용액에 매우 적은 양의 RNase가 존재한다면 다음 실험에서 그 역할을 수행하기에 매우 적합한 환경과 시간이 있을 것이고, 이때의 실험은 당연히 차가워질 것입니다.아래에서는 RNA 용액에 잔류 RNase가 있는지 확인할 수 있는 방법을 소개합니다.
3. 보온성 시험
시료 농도에 따라 RNA 용액에서 1000ng RNA 2개를 뽑아 0.5ml 원심분리기 튜브에 넣고 pH 7.0 Tris 완충액으로 총 부피가 10ul가 되도록 보충한 후 튜브의 뚜껑을 밀봉한다.그 중 하나를 70°C의 항온 수조에 넣고 1시간 동안 보온합니다.다른 부분은 -20°C 냉장고에 1시간 동안 보관했습니다.시간이 다 되면 전기영동을 위해 두 개의 샘플을 제거합니다.전기영동이 끝나면 두 전기영동 밴드를 비교한다.둘의 밴드가 일치하거나 큰 차이가 없다면(물론 그들의 밴드도 방법 2의 조건을 충족함) RNA 용액에 잔류 RNase 오염이 없고 RNA의 품질이 매우 좋다는 것을 의미합니다.반대로 70°C에서 배양한 샘플이 확연한 분해를 보인다면 RNA 용액에 RNase 오염이 있음을 나타냅니다.
2 RNA 추출을 위한 실험 방법 및 기법
RNA를 추출할 때 자주 발생하는 문제는 다음과 같습니다. (1) RNA 수율이 낮습니다.(2) RNA는 심각한 염 오염을 가지고 있습니다.(3) RNA는 심각한 유기 용매 오염을 가지고 있습니다.(4) 샘플 열화 및 기타 문제
1. 일반적으로 사용되는 total RNA 추출 시약
guanidine isothiocyanate법과 Trizol법은 동물조직 및 동물세포로부터 total RNA를 추출하는데 가장 많이 사용되는 방법이다.토끼 피부 및 동물 결합 조직에서 총 RNA 추출과 같이 특히 추출하기 어려운 작은 샘플 및 조직에 특히 적합합니다.또한 Trizol은 범용 용해 시약으로 식물 조직, 박테리아, 곰팡이 및 기타 조직 추출에도 사용할 수 있습니다.동백나무, 찻잎, 유채 등 다당류와 폴리페놀을 함유한 식물 조직의 경우 CTAB 방법을 사용하여 total RNA를 추출할 수도 있습니다.
기존 방법으로 이중 컬럼 방법도 상온 작동, RNase 추가 필요 없음, 추출을 위한 클로로포름, 페놀 및 기타 유기 시약이 없는 안전성으로 인해 매우 인기가 있습니다.(추천 제품 )
2. 동물 조직에서 total RNA 추출
(1) 신선하지 않은 경우 신선한 조직을 선택하십시오(바람직하게는 3개월 이내 - 80℃ 냉장고 또는 액체 질소에서 냉동. 조직을 절단할 때 상온에서 직접 절단하지 말고 반드시 얼음 상자에 넣고 반복적인 동결 및 해동을 피하십시오.
(2) 깨끗한 가위와 핀셋을 사용하여 조직의 작은 조각을 자르거나, 샘플을 자를 때 조직의 중앙 부분을 자르거나, 먼저 중앙에서 큰 조직 조각을 자른 다음 신선한 절개 위치에서 샘플을 자릅니다.제거된 조직을 완전히 파쇄하고 파쇄된 조직을 RNase가 없는 EP 튜브에 넣고 lysate를 첨가한 후 파쇄된 조직을 lysate에 완전히 노출시키고 균질화를 준비합니다.
(3) 정상 조직의 경우 녹두 크기의 조직(30~60mg)을 선택하여 균질화한다.조직에 단백질, 지방, 간과 같은 치밀한 섬유조직이 많은 경우 절단조직의 양을 적절히 증감한다(선택사항) 10~20mg 선택).
(4) 어육, 새우살, 해파리 등 수분 함량이 높은 조직을 추출할 경우 시료량을 적절히 증가시켜야 한다(권장 100-200 mg).
(5) 여건이 허락하는 경우 동물의 조직을 high-passage 조직균질기로 균질화한 후 해당 장비가 없는 경우 직접 추출할 수 있다.
(6) 최종 추출 후 얻은 RNA는 RNA의 분해를 줄이기 위해 즉시 아이스박스에 넣어야 합니다.
3. 동물세포 RNA 추출
(1) 현탁액 세포: 직접 원심분리하여 배지를 버리고 멸균 PBS로 1-2회 세척한 후 적당량의 PBS로 부유시킨 다음 용해물을 첨가하여 용해시킨다.액체를 완전히 버린 후 침전된 세포에 용해물을 직접 추가하지 마십시오.이렇게 하면 외부 층의 용해된 세포가 침전된 세포의 외부에 부착된 후 방출된 히스톤 패키지가 펠릿 내부의 세포와 용해물과의 접촉을 제한하게 됩니다., 불완전한 세포 용해 및 감소된 RNA 수율을 초래합니다.
(2) semi-adherent 또는 단단하게 부착되지 않은 세포: 배지를 버린 후 PBS로 1~2회 세척한 후 PBS 적당량을 직접 흡수하고 배양 접시에 pipette 또는 gun으로 불어서 세포를 날려준 후 RNA-free 세포로 옮긴다.추출을 위해 효소의 EP 튜브에 lysate를 추가합니다.
(3) 부착 세포: 먼저 트립신으로 분해한 다음 RNase-free EP 튜브에 수집하고, 원심분리하여 상층액을 제거하고, PBS로 1-2회 세척하여 과잉 트립신을 제거하고, 적절한 양의 PBS로 재현탁한 다음 추출 단계를 진행합니다.
4. 식물 RNA 추출
식물 조직은 페놀 화합물이 풍부하거나 다당류가 풍부하거나 일부 미확인 2차 대사산물을 포함하거나 RNase 활성이 높습니다.이러한 물질은 세포 용해 후 RNA와 단단하게 결합되어 제거하기 어려운 불용성 복합체 또는 콜로이드 침전물을 형성합니다.따라서 식물 조직을 추출할 때 식물을 위한 키트를 선택해야 합니다.키트의 용해물은 폴리페놀의 쉬운 산화 및 다당류 화합물과 핵산의 분리 문제를 효과적으로 해결할 수 있습니다.
(Polysaccharide polyphenol plant RNA 추출을 위한 권장 제품:
(1) 식물의 껍질, 과육, 종자, 잎 등을 절구에 완전히 갈아야 한다.그라인딩 과정에서 샘플이 녹는 것을 방지하기 위해 액체 질소를 적시에 보충해야 합니다.RNA 분해를 피하기 위해 지상 샘플을 용해물에 신속하게 추가하고 흔들어야 합니다.
(2) 쌀, 밀잎과 같이 섬유질이 풍부한 시료의 경우 추출량을 적절하게 줄여야 합니다. 그렇지 않으면 조직 분쇄 및 용해가 완료되지 않아 RNA 추출 수율이 낮아집니다.
(3) 석류 열매, 수박 열매, 복숭아 열매 등과 같이 수분 함량이 높은 식물 조직의 경우 시료 크기를 적절히 증가시켜야 합니다(100-200 mg은 선택 사항).
(4) 식물 잎, 뿌리 줄기, 단단한 과일 및 기타 재료와 같은 식물 조직은 일반적으로 액체 질소를 사용하여 재료를 절구에 철저히 절구 한 다음 추출 단계를 진행하는 것이 좋습니다.기존의 조직 균질기는 식물 조직을 균질화하는 데 효과적이지 않을 수 있으며 일반적으로 권장되지 않습니다.
5. RNA 추출시 주의사항
(1) 조직 검체는 반복적인 동결과 해동을 피하기 위해 가능한 한 신선해야 합니다.
(2) 조직은 적출 시 충분히 갈아야 하며, 조직의 양은 너무 많거나 적지 않아야 한다.
(3) 시료를 완전히 용해시키기 위해 용해물을 첨가한 후 충분한 배양 시간을 주어야 합니다.
(4) Trizol법을 이용하여 추출할 경우 계층화 후 상등액을 흡수하는 원리는 "많이 들이마시는 것보다 적게 들이마시는 것을 선호한다"이며, 중간층까지 추출하면 안되며 심각한 genomic DNA 오염을 일으킬 수 있다.
(5) 세척 시 세척액이 튜브 벽 주위로 충분히 스며들도록 하여 철저히 세척한다.
(6) 컬럼 추출 방법의 경우 세척 후 컬럼을 분리하는 것 외에도 흡착 컬럼도 울트라 클린 벤치에 놓고 5-10분 동안 불어서 유기 용매를 완전히 증발시켜 건조시켜야 합니다.
(7) 컬럼법의 마지막 용출시 DEPC water를 첨가한 후 3~5분간 incubation하거나 DEPC water를 미리 60℃로 가열하여 용출 수율을 높여야 한다.기존의 Trizol cleavage와 isopropanol 침전법은 최종 RNA를 DEPC water에 용해시키므로 용해에 적당한 시간을 두고 원심분리관의 바닥을 피펫팁으로 계속 불어주어야 한다.
3T세 가지 낮은 RNA 농도/나쁜 품질의 원인과 해결책
1. 수율이 너무 낮다
추출된 샘플이 너무 적거나 총량이 불충분하거나 추출된 샘플이 너무 많아 용해가 완료되지 않았습니다.적절한 품질의 조직 또는 세포를 추출에 사용해야 하고, 시료의 전처리가 잘 이루어져야 하며, 용해가 충분해야 합니다.
2. 게놈 잔기
Trizol법으로 추출할 때 상등액이 층상 후 중간층으로 빨려 들어갈 경우 심각한 게놈 오염을 일으키게 되며;중층으로 빨려 들어가지 않도록 레이어링 시 각별한 주의가 필요합니다.컬럼 방식으로 추출하는 경우 DNase I이 포함된 키트를 선택하여 추출할 수 있습니다.멤브레인에 흡착된 핵산은 DNase I로 직접 분해되어 DNA 잔류물을 크게 줄일 수 있습니다.
3. RNA 분해
추출된 시료 자체의 열화일 수도 있고 추출 과정에서 발생한 열화일 수도 있습니다.RNA추출은 가능한 한 신선한 검체를 사용하고 채취한 검체는 적시에 액체질소나 -80℃ 냉장고에 보관하고 반복적인 동결과 해동은 피해야 한다.RNase/DNase free 팁, 원심분리기 튜브 및 기타 재료는 RNA 추출 과정에서 사용해야 합니다.추출 과정은 가능한 한 빨라야 합니다.추출된 RNA는 아이스박스에 넣어 -80℃에서 보관해야 합니다.추출된 RNA를 겔 전기영동으로 검출해야 하는 경우 추출 후 즉시 전기영동을 실시하고 전기영동 완충용액은 새로 준비한 것으로 교체해야 합니다.
4. 염 및 유기 용매 잔류물
추출 시약에는 페놀 및 구아니딘염이 포함되어 있고 세척액에는 에탄올이 포함되어 있습니다.추출 과정에서 lysate가 완전히 흡수되지 않고 폐기되었으며 세척액이 완전히 건조되지 않았습니다.잔류 염 및 유기 용매는 후속 역전사 및 PCR에 유해합니다.억제 정도가 다르기 때문에 추출 과정에서 조직 용해물을 완전히 제거해야 하며 세척은 튜브의 주변 벽을 세척할 수 있도록 충분해야 합니다.또한, 튜브를 비우고 불어내는 것은 유기물 잔류물을 더욱 줄이는 필수 단계입니다.
RNA 추출에 대한 자세한 내용은 다음 웹사이트를 참조하십시오.
자세한 내용은 www.foreivd.com을 참조하십시오.
게시 시간: Dec-01-2022
