내가 생각하는 검출 기술의 역사에서 몇 가지 혁신적인 발명은 항원-항체 특이적 결합 원리에 기초한 면역 표지 기술, PCR 기술 및 시퀀싱 기술입니다.오늘 우리는 PCR 기술에 대해 이야기할 것입니다.PCR 기술의 진화에 따라 사람들은 일반적으로 PCR 기술을 일반 PCR 기술, 실시간 형광 정량 PCR 기술 및 디지털 PCR 기술의 3세대로 나눕니다.
C오몬 PCR 기술
캐리 멀리스 (1944.12.28-2019.8.7)
캐리 멀리스는 1983년 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 발명했다. 여자친구를 운전하던 중 문득 문득 영감이 번쩍 들어 PCR(운전의 이득에 관한)의 원리를 떠올렸다고 한다.Kary Mullis는 1993년에 노벨 화학상을 수상했습니다. New York Times는 다음과 같이 말했습니다.
PCR의 원리: DNA 중합효소의 촉매 작용 하에서 모가닥 DNA를 주형으로 사용하고 특정 프라이머를 확장의 시작점으로 사용하며 모가닥 주형 DNA에 상보적인 딸가닥 DNA는 변성, 어닐링, 확장 및 기타 단계를 통해 시험관 내에서 복사됩니다.in vitro에서 어떠한 target DNA도 신속하고 특이적으로 증폭시킬 수 있는 in vitro DNA 합성 증폭 기술입니다.
일반 PCR의 장점
1.고전적인 방법, 완벽한 국제 및 국내 표준
2.기기 시약 비용 절감
3.다른 분자 생물학 실험을 위해 PCR 제품을 회수할 수 있습니다.
권장 Foregene PCR 기계: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
관련 제품: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
일반 PCR의 단점
1.오염되기 쉬운
2.번거로운 작업
3.오직 질적 분석
4.적당한 감도
5.비특정 증폭이 있으며, 비특정 대역이 타겟 대역과 같은 크기일 때 구분이 안됨
C모세관 전기영동 기반 PCR
일반 PCR의 단점에 대응하여 일부 제조업체에서는 모세관 전기영동 원리에 기반한 기기를 도입했습니다.모세관에서 PCR 증폭 후 전기영동 단계가 완료됩니다.MAERKER로 감도가 높아 여러 염기의 차이를 구분할 수 있고 증폭도를 계산할 수 있습니다.제품 내용.단점은 여전히 PCR 산물을 개봉하여 기기에 넣어야 하고 여전히 오염 위험이 크다는 것입니다.
C모세관E전기 영동
2. 실시간 형광 정량 PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR) 기술Real-Time PCR이라고도 불리는 형광 정량 PCR은 1995년 PE(Perkin Elmer)에서 개발한 새로운 핵산 정량 기술입니다. 형광 정량 PCR의 개발 역사는 ABI, Roche, Bio-Rad와 같은 거대 기업의 영혼을 휘젓는 투쟁의 역사입니다.관심이 있으시면 확인하실 수 있습니다.이 기술은 현재 가장 성숙하고 널리 사용되는 반정량적 PCR 기술입니다.
권장 qPCR 머신:https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
형광염료법(SYBR Green I):SYBR Green I은 이중가닥 DNA에 비특이적으로 결합하는 정량적 PCR에 가장 많이 사용되는 DNA 결합염료입니다.자유 상태에서 SYBR Green은 약한 형광을 발산하지만 일단 이중 가닥 DNA에 결합하면 형광이 1000배 증가합니다.따라서 반응에 의해 방출되는 총 형광 신호는 존재하는 이중 가닥 DNA의 양에 비례하며 증폭 산물이 증가함에 따라 증가합니다.염료는 이중 가닥 DNA에 비특이적으로 결합하기 때문에 위양성 결과가 생성될 수 있습니다.
관련 제품: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
형광 프로브 방법(Taqman 기술): 동안PCR 증폭은 특정 형광 프로브가 한 쌍의 프라이머와 동시에 추가됩니다.프로브는 선형 올리고뉴클레오타이드이며, 형광 리포터 그룹과 형광 소광제 그룹이 양쪽 끝에 각각 표시되어 있습니다.프로브가 손상되지 않은 경우 리포터 그룹에서 방출된 형광 신호가 소광기 그룹에 의해 흡수되고 검출에는 형광 신호가 없습니다.PCR 증폭 동안(연장 단계에서) Taq 효소의 5'-3' Dicer 활성은 프로브를 소화 및 분해하여 리포터 형광 그룹과 소광제 형광 그룹을 분리하여 형광 모니터링 시스템에서 형광 신호를 수신할 수 있습니다. 즉, DNA 사슬이 증폭될 때마다 형광 분자가 형성되어 형광 신호 축적과 PCR 산물 형성의 완전한 동기화를 실현합니다.Taqman 프로브 방법은 임상 검출에서 가장 일반적으로 사용되는 검출 방법입니다.
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qPCR의 장점
1.방법이 성숙하고 지원 장비 및 시약이 완성되었습니다.
2.시약의 중간 비용
3.사용하기 쉬운
4.높은 검출 감도 및 특이성
qPCR의 단점
표적 유전자의 돌연변이는 검출을 놓치게 합니다.
저농도 템플릿의 검출 결과를 확인할 수 없습니다.
정량적 검출을 위해 표준 곡선을 사용할 때 큰 오차가 있습니다.
3. 디지털 PCR(digital PCR, dPCR) 기술
디지털 PCR은 핵산 분자의 절대 정량화 기술입니다.qPCR과 비교하여 디지털 PCR은 DNA/RNA 분자의 수를 직접 읽을 수 있으며, 이는 시작 샘플에서 핵산 분자의 절대 정량화입니다.1999년 Bert Vogelstein과 Kenneth W. Kin-zler는 dPCR의 개념을 공식적으로 제안했습니다.
2006년 Fluidigm은 상업용 칩 기반 dPCR 기기를 최초로 생산했습니다.2009년에 Life Technologies는 OpenArray 및 QuantStudio 12K Flex dPCR 시스템을 출시했습니다.2013년 Life Technologies는 고밀도 나노스케일 미세 유체 칩 기술을 사용하여 샘플을 20,000개의 개별 세포에 고르게 분배하는 QuantStudio 3DdPCR 시스템을 출시했습니다.반응 잘.
2011년 Bio-Rad는 water-in-oil 기술을 사용하여 시료를 20,000개의 droplet-water-in-oil에 균일하게 분배하고, droplet analyzer를 사용하여 물방울을 분석하는 물방울 기반 QX100 dPCR 기기를 출시했습니다.2012년 RainDance는 고압 가스로 구동되는 RainDrop dPCR 기기를 출시하여 각 표준 반응 시스템을 100만 ~ 1000만 피코리터 수준의 미세 방울을 포함하는 반응 에멀젼으로 나눕니다.
지금까지 디지털 PCR은 칩 유형과 액적 유형의 두 가지 주요 파벌을 형성했습니다.어떤 종류의 디지털 PCR이든 그 핵심 원칙은 희석, 종점 PCR 및 포아송 분포를 제한하는 것입니다.핵산 주형이 들어 있는 표준 PCR 반응 시스템은 수만 개의 PCR 반응으로 고루 분할되어 칩이나 미세 방울에 분산되어 각 반응에 가능한 한 주형 분자가 많이 포함되도록 하고 단일 분자 주형 PCR 반응을 수행합니다.형광을 읽어 신호의 유무를 카운트하고, 통계적 푸아송 분포를 보정한 후 절대 정량화합니다.
다음은 내가 사용한 여러 디지털 PCR 플랫폼의 특성입니다.
1. Bio-Rad QX200 액적 디지털 PCR Bio-RadQX200은 매우 고전적인 디지털 PCR 플랫폼이며 기본 검출 프로세스입니다. 20,000개의 샘플이 액적 생성기에 의해 생성됩니다. Water-in-oil 마이크로 액적은 일반 PCR 기계에서 증폭되고 최종적으로 각 마이크로 액적의 형광 신호는 마이크로 액적 판독기로 읽힙니다.작업이 더 복잡하고 오염 위험이 중간입니다.
Xinyi TD1 마이크로 액적 디지털 PCRXinyi TD1은 국내 디지털 PCR 플랫폼으로 기본 검출 프로세스입니다. 액적 생성기를 통해 30,000-50,000개의 water-in-oil 액적을 생성하고 일반적인 PCR 기기에서 증폭한 다음 최종적으로 통과합니다. 액적 리더는 각 액적의 형광 신호를 읽습니다.이 플랫폼의 액적 생성 및 판독은 모두 오염 위험이 낮은 전용 칩에서 수행됩니다.
STILLA Naica 마이크로 액적 칩 디지털 PCRSTILLA Naica는 비교적 새로운 디지털 PCR 플랫폼입니다.기본 검출 프로세스는 칩에 반응 용액을 추가하고 칩을 미세 방울 생성 및 증폭 시스템에 넣고 30,000개의 미세 방울을 생성하는 것입니다.칩에 펴 바르면 칩에서 PCR 증폭이 완료됩니다.그런 다음 증폭된 칩을 마이크로 액적 판독 분석 시스템으로 옮기고 사진을 찍어 형광 신호를 판독합니다.전체 공정이 폐쇄형 칩에서 이루어지기 때문에 오염 위험이 낮습니다.
4. ThermoFisher QuantStudio 3D 칩 디지털 PCR
ThermoFisher QuantStudio 3D는 또 다른 고전적인 칩 기반 디지털 PCR 플랫폼입니다.기본 검출 프로세스는 반응 용액을 스프레더에 추가하고 스프레더를 통해 20,000 마이크로웰로 칩에 반응 용액을 고르게 퍼뜨리는 것입니다., 칩을 PCR 기계에 올려 증폭하고 마지막으로 칩을 리더기에 넣고 사진을 찍어 형광 신호를 읽습니다.작업이 상대적으로 복잡하고 전체 공정이 폐쇄형 칩에서 수행되며 오염 위험이 낮습니다.
5. JN MEDSYS Clarity 칩 디지털 PCR
JN MEDSYS Clarity는 비교적 새로운 칩 형태의 디지털 PCR 플랫폼입니다.기본 검출 과정은 반응 용액을 Applicator에 넣고 Applicator를 통해 PCR Tube에 고정된 10,000개의 PCR Tube에 반응 용액을 고르게 펴 바르는 것입니다.미세다공성 칩 위에서 모세관 현상을 통해 반응액이 칩 안으로 들어가고, 칩이 붙은 PCR 튜브를 PCR 기계에 올려 증폭한 뒤 마지막으로 칩을 리더기에 집어넣고 사진을 찍어 형광 신호를 읽는다.작업이 더 복잡합니다.오염의 위험이 적습니다.
각 디지털 PCR 플랫폼의 매개변수는 다음과 같이 요약됩니다.
디지털 PCR 플랫폼의 평가 지표는 분할 단위 수, 형광 채널 수, 작업 복잡성 및 오염 위험입니다.그러나 가장 중요한 것은 탐지 정확도입니다.디지털 PCR 플랫폼을 평가하는 한 가지 방법은 여러 디지털 PCR 플랫폼을 사용하여 서로를 검증하는 것이고 또 다른 방법은 정확한 값을 가진 표준 물질을 사용하는 것입니다.
dPCR의 장점
1.절대 정량화 달성
2.더 높은 민감도 및 특이도
3.복사량이 적은 샘플을 감지할 수 있습니다.
dPCR의 단점1. 고가의 장비 및 시약 2. 복잡한 작업 및 긴 검출 시간 3. 좁은 검출 범위
현재 PCR 기술의 3세대는 장단점이 있고 각각 고유한 응용 분야가 있으며 한 세대가 다른 세대를 대체하는 관계가 아닙니다.기술의 지속적인 발전은 PCR 기술에 새로운 생명력을 불어넣어 응용 방향을 하나씩 열어 핵산 검출을 보다 편리하고 정확하게 할 수 있도록 했습니다.
출처: Dr. Yuan이 테스트를 위해 귀하를 데려갑니다.
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게시 시간: 2022년 11월 18일
