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출발 물질: RNA

정량적 역전사 PCR(RT-qPCR)은 RNA를 출발 물질로 사용하는 PCR 실험에 사용되는 실험 방법입니다.이 방법에서는 총 RNA 또는 메신저 RNA(mRNA)가 먼저 역전사 효소에 의해 상보적 DNA(cDNA)로 전사됩니다.그 후, cDNA를 주형으로 하여 qPCR 반응을 수행하였다.RT-qPCR은 유전자 발현 분석, RNA 간섭 검증, 마이크로어레이 검증, 병원체 검출, 유전자 검사 및 질병 연구를 포함한 다양한 분자 생물학 응용 ​​분야에 사용되었습니다.

RT-qPCR을 위한 1단계 및 2단계 방법

RT-qPCR은 1단계 또는 2단계 방법으로 수행할 수 있습니다.원스텝 RT-qPCR은 역전사 및 PCR 증폭을 결합하여 역전사 효소와 DNA 중합 효소가 동일한 버퍼 조건에서 동일한 튜브에서 반응을 완료할 수 있도록 합니다.원스텝 RT-qPCR은 시퀀스별 프라이머만 사용하면 됩니다.2단계 RT-qPCR에서 역전사 및 PCR 증폭은 서로 다른 최적화된 버퍼, 반응 조건 및 프라이머 디자인 전략을 사용하여 두 개의 튜브에서 수행됩니다.

기사1

 

이점

불리

한 걸음 이 방법은 두 반응이 하나의 튜브에서 이루어지기 때문에 실험 오류가 적습니다.

 

적은 파이펫팅 단계로 오염 위험 감소

 

고처리량 증폭/스크리닝에 적합, 빠르고 재현 가능

2단계 반응은 개별적으로 최적화할 수 없습니다.

 

2단계 반응을 조합하여 반응 조건을 절충하기 때문에 2단계 방법에 비해 감도가 좋지 않음

 

단일 샘플에서 탐지된 대상의 수가 적습니다.

두 단계 장기간 보관 및 여러 반응에 사용할 수 있는 안정적인 cDNA 라이브러리 생성 능력

 

여러 cDNA 라이브러리 없이 동일한 cDNA 라이브러리에서 표적 유전자와 참조 유전자를 증폭할 수 있습니다.

 

단일 반응 실행을 최적화할 수 있는 반응 버퍼 및 반응 조건

 

트리거 조건의 유연한 선택

여러 개의 튜브를 사용하고 더 많은 파이펫팅 단계는 DNA 오염의 위험을 증가시킵니다.

시간이 많이 걸립니다.

 

원스텝 방식보다 더 많은 최적화 필요

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총 RNA 및 mRNA의 선택

RT-qPCR 실험을 설계할 때 역전사를 위한 템플릿으로 총 RNA 또는 정제된 mRNA를 사용할지 여부를 결정하는 것이 중요합니다.mRNA가 약간 더 높은 감도를 제공할 수 있지만 전체 RNA는 여전히 자주 사용됩니다.그 이유는 total RNA가 mRNA보다 출발물질로서 더 중요한 이점을 가지고 있기 때문이다.첫째, 이 프로세스는 더 적은 정제 단계를 필요로 하므로 템플릿의 더 나은 정량적 복구와 시작 세포 번호에 대한 결과의 더 나은 정규화를 보장합니다.둘째, mRNA 농축 단계를 피하여 다른 mRNA의 다른 회수로 인해 왜곡된 결과의 가능성을 피할 수 있습니다.전반적으로, 대부분의 응용 프로그램에서 표적 유전자의 상대적 정량화가 검출의 절대 감도보다 더 중요하기 때문에 전체 RNA가 대부분의 경우에 더 적합합니다.

역전사 프라이머

2단계 방법에서는 oligo(dT) 프라이머, 무작위 프라이머 또는 서열별 프라이머의 세 가지 다른 방법을 사용하여 cDNA 반응을 프라이밍할 수 있습니다.일반적으로 올리고(dT) 프라이머와 랜덤 프라이머를 조합하여 사용합니다.이 프라이머는 주형 mRNA 가닥에 어닐링하고 역전사 효소에 합성 시작점을 제공합니다.

기사2

프라이머 선택 구조와 기능 이점 불리
올리고(dT) 프라이머(또는 고정 올리고(dT) 프라이머) mRNA의 폴리(A) 꼬리에 있는 티민 잔기에 대한 연장된 어닐링;앵커 올리고(dT) 프라이머는 3' 말단(앵커 사이트)에 G, C 또는 A를 포함합니다. poly(A)-tailed mRNA로부터 full-length cDNA 합성

 

사용 가능한 출발 물질이 적을 때 적용 가능

 

고정 부위는 올리고(dT) 프라이머가 mRNA의 5' 폴리(A) 꼬리에 결합하도록 합니다.

poly(A) 꼬리가 있는 유전자 증폭에만 적합

 

poly(A)의 프라이밍 사이트*2에서 잘린 cDNA를 얻습니다.

 

3' 말단에 결합하도록 편향됨*

 

*이 가능성은 고정 올리고(dT) 프라이머를 사용하는 경우 최소화됩니다.

랜덤 프라이머

 

길이가 6~9개 염기이며 RNA 전사 중에 여러 부위에 어닐링할 수 있습니다. 모든 RNA(tRNA, rRNA 및 mRNA)에 어닐링

 

중요한 2차 구조가 있는 전사물 또는 사용 가능한 시작 물질이 적은 경우에 적합합니다.

 

높은 cDNA 수율

cDNA는 모든 RNA에서 역전사되는데, 이는 일반적으로 바람직하지 않으며 표적 mRNA의 신호를 희석시킬 수 있습니다.

 

잘린 cDNA 얻기

서열 특이적 프라이머 특정 mRNA 서열을 표적으로 하는 맞춤형 프라이머 특정 cDNA 라이브러리

 

감도 향상

 

역 qPCR 프라이머 사용

단일 표적 유전자의 합성에만 국한됨

역전사 효소

역전사 효소는 RNA를 사용하여 DNA를 합성하는 효소입니다.일부 역전사 효소는 RNase 활성을 가지며 전사 후 RNA-DNA 혼성 가닥에서 RNA 가닥을 분해할 수 있습니다.RNase 효소 활성이 없는 경우 qPCR 효율을 높이기 위해 RNaseH를 추가할 수 있습니다.일반적으로 사용되는 효소에는 Moloney 쥐 백혈병 바이러스 역전사효소 및 조류 골수모세포종 바이러스 역전사효소가 포함됩니다.RT-qPCR의 경우 열 안정성이 더 높은 역전사 효소를 선택하는 것이 이상적입니다. 그러면 cDNA 합성이 더 높은 온도에서 수행될 수 있으므로 더 높은 2차 구조를 가진 RNA의 성공적인 전사를 보장하는 동시에 반응 전반에 걸쳐 완전한 활성을 유지하여 더 높은 cDNA 수율을 얻을 수 있습니다.

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역전사 효소의 RNase H 활성

RNaseH는 RNA-DNA 듀플렉스에서 RNA 가닥을 분해하여 이중 가닥 DNA를 효율적으로 합성할 수 있습니다.그러나 긴 mRNA를 주형으로 사용하면 RNA가 조기에 분해되어 잘린 cDNA가 될 수 있습니다.따라서 긴 전사체의 합성이 필요한 경우 cDNA 클로닝 중에 RNaseH 활성을 최소화하는 것이 종종 유익합니다.대조적으로, RNase H 활성이 있는 역전사 효소는 PCR의 첫 번째 주기 동안 RNA-DNA 듀플렉스의 용융을 향상시키기 때문에 종종 qPCR 응용 분야에 유익합니다.

프라이머 디자인

RT-qPCR에서 qPCR 단계에 사용되는 PCR 프라이머는 이상적으로 증폭 프라이머가 실제 엑손-인트론 경계에 걸쳐 있을 수 있는 엑손-엑손 접합부에 걸쳐 있도록 설계되어야 합니다.인트론 함유 게놈 DNA 서열은 증폭되지 않기 때문에 이 디자인은 오염된 게놈 DNA로 인해 증폭되는 위양성의 위험을 줄입니다.

엑손 또는 엑손-엑손 경계를 분리하도록 프라이머를 설계할 수 없는 경우 RNA 샘플을 RNase-free DNase I 또는 dsDNase로 처리하여 게놈 DNA 오염을 제거해야 할 수 있습니다.

RT-qPCR 제어

역전사 음성 대조군(-RT 대조군)은 DNA 오염(예: 이전 반응의 게놈 DNA 또는 PCR 제품)을 검출하기 위해 모든 RT-qPCR 실험에 포함되어야 합니다.이 컨트롤에는 역전사 효소를 제외한 모든 반응 구성 요소가 포함되어 있습니다.이 컨트롤은 역전사를 일으키지 않기 때문에 PCR 증폭이 관찰되면 DNA 오염일 가능성이 높습니다.


게시 시간: 2022년 8월 2일