출발 물질: RNA
정량적 역전사 PCR(RT-qPCR)은 RNA를 출발 물질로 사용하는 PCR 실험에 사용되는 실험 방법입니다.이 방법에서는 총 RNA 또는 메신저 RNA(mRNA)가 먼저 역전사 효소에 의해 상보적 DNA(cDNA)로 전사됩니다.그 후, cDNA를 주형으로 하여 qPCR 반응을 수행하였다.RT-qPCR은 유전자 발현 분석, RNA 간섭 검증, 마이크로어레이 검증, 병원체 검출, 유전자 검사 및 질병 연구를 포함한 다양한 분자 생물학 응용 분야에 사용되었습니다.
RT-qPCR을 위한 1단계 및 2단계 방법
RT-qPCR은 1단계 또는 2단계 방법으로 수행할 수 있습니다.원스텝 RT-qPCR은 역전사 및 PCR 증폭을 결합하여 역전사 효소와 DNA 중합 효소가 동일한 버퍼 조건에서 동일한 튜브에서 반응을 완료할 수 있도록 합니다.원스텝 RT-qPCR은 시퀀스별 프라이머만 사용하면 됩니다.2단계 RT-qPCR에서 역전사 및 PCR 증폭은 서로 다른 최적화된 버퍼, 반응 조건 및 프라이머 디자인 전략을 사용하여 두 개의 튜브에서 수행됩니다.
이점 | 불리 | |
한 걸음 | 이 방법은 두 반응이 하나의 튜브에서 이루어지기 때문에 실험 오류가 적습니다.
적은 파이펫팅 단계로 오염 위험 감소
고처리량 증폭/스크리닝에 적합, 빠르고 재현 가능 | 2단계 반응은 개별적으로 최적화할 수 없습니다.
2단계 반응을 조합하여 반응 조건을 절충하기 때문에 2단계 방법에 비해 감도가 좋지 않음
단일 샘플에서 탐지된 대상의 수가 적습니다. |
두 단계 | 장기간 보관 및 여러 반응에 사용할 수 있는 안정적인 cDNA 라이브러리 생성 능력
여러 cDNA 라이브러리 없이 동일한 cDNA 라이브러리에서 표적 유전자와 참조 유전자를 증폭할 수 있습니다.
단일 반응 실행을 최적화할 수 있는 반응 버퍼 및 반응 조건
트리거 조건의 유연한 선택 | 여러 개의 튜브를 사용하고 더 많은 파이펫팅 단계는 DNA 오염의 위험을 증가시킵니다. 시간이 많이 걸립니다.
원스텝 방식보다 더 많은 최적화 필요 |
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총 RNA 및 mRNA의 선택
RT-qPCR 실험을 설계할 때 역전사를 위한 템플릿으로 총 RNA 또는 정제된 mRNA를 사용할지 여부를 결정하는 것이 중요합니다.mRNA가 약간 더 높은 감도를 제공할 수 있지만 전체 RNA는 여전히 자주 사용됩니다.그 이유는 total RNA가 mRNA보다 출발물질로서 더 중요한 이점을 가지고 있기 때문이다.첫째, 이 프로세스는 더 적은 정제 단계를 필요로 하므로 템플릿의 더 나은 정량적 복구와 시작 세포 번호에 대한 결과의 더 나은 정규화를 보장합니다.둘째, mRNA 농축 단계를 피하여 다른 mRNA의 다른 회수로 인해 왜곡된 결과의 가능성을 피할 수 있습니다.전반적으로, 대부분의 응용 프로그램에서 표적 유전자의 상대적 정량화가 검출의 절대 감도보다 더 중요하기 때문에 전체 RNA가 대부분의 경우에 더 적합합니다.
역전사 프라이머
2단계 방법에서는 oligo(dT) 프라이머, 무작위 프라이머 또는 서열별 프라이머의 세 가지 다른 방법을 사용하여 cDNA 반응을 프라이밍할 수 있습니다.일반적으로 올리고(dT) 프라이머와 랜덤 프라이머를 조합하여 사용합니다.이 프라이머는 주형 mRNA 가닥에 어닐링하고 역전사 효소에 합성 시작점을 제공합니다.
프라이머 선택 | 구조와 기능 | 이점 | 불리 |
올리고(dT) 프라이머(또는 고정 올리고(dT) 프라이머) | mRNA의 폴리(A) 꼬리에 있는 티민 잔기에 대한 연장된 어닐링;앵커 올리고(dT) 프라이머는 3' 말단(앵커 사이트)에 G, C 또는 A를 포함합니다. | poly(A)-tailed mRNA로부터 full-length cDNA 합성
사용 가능한 출발 물질이 적을 때 적용 가능
고정 부위는 올리고(dT) 프라이머가 mRNA의 5' 폴리(A) 꼬리에 결합하도록 합니다. | poly(A) 꼬리가 있는 유전자 증폭에만 적합
poly(A)의 프라이밍 사이트*2에서 잘린 cDNA를 얻습니다.
3' 말단에 결합하도록 편향됨*
*이 가능성은 고정 올리고(dT) 프라이머를 사용하는 경우 최소화됩니다. |
랜덤 프라이머
| 길이가 6~9개 염기이며 RNA 전사 중에 여러 부위에 어닐링할 수 있습니다. | 모든 RNA(tRNA, rRNA 및 mRNA)에 어닐링
중요한 2차 구조가 있는 전사물 또는 사용 가능한 시작 물질이 적은 경우에 적합합니다.
높은 cDNA 수율 | cDNA는 모든 RNA에서 역전사되는데, 이는 일반적으로 바람직하지 않으며 표적 mRNA의 신호를 희석시킬 수 있습니다.
잘린 cDNA 얻기 |
서열 특이적 프라이머 | 특정 mRNA 서열을 표적으로 하는 맞춤형 프라이머 | 특정 cDNA 라이브러리
감도 향상
역 qPCR 프라이머 사용 | 단일 표적 유전자의 합성에만 국한됨 |
역전사 효소
역전사 효소는 RNA를 사용하여 DNA를 합성하는 효소입니다.일부 역전사 효소는 RNase 활성을 가지며 전사 후 RNA-DNA 혼성 가닥에서 RNA 가닥을 분해할 수 있습니다.RNase 효소 활성이 없는 경우 qPCR 효율을 높이기 위해 RNaseH를 추가할 수 있습니다.일반적으로 사용되는 효소에는 Moloney 쥐 백혈병 바이러스 역전사효소 및 조류 골수모세포종 바이러스 역전사효소가 포함됩니다.RT-qPCR의 경우 열 안정성이 더 높은 역전사 효소를 선택하는 것이 이상적입니다. 그러면 cDNA 합성이 더 높은 온도에서 수행될 수 있으므로 더 높은 2차 구조를 가진 RNA의 성공적인 전사를 보장하는 동시에 반응 전반에 걸쳐 완전한 활성을 유지하여 더 높은 cDNA 수율을 얻을 수 있습니다.
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역전사 효소의 RNase H 활성
RNaseH는 RNA-DNA 듀플렉스에서 RNA 가닥을 분해하여 이중 가닥 DNA를 효율적으로 합성할 수 있습니다.그러나 긴 mRNA를 주형으로 사용하면 RNA가 조기에 분해되어 잘린 cDNA가 될 수 있습니다.따라서 긴 전사체의 합성이 필요한 경우 cDNA 클로닝 중에 RNaseH 활성을 최소화하는 것이 종종 유익합니다.대조적으로, RNase H 활성이 있는 역전사 효소는 PCR의 첫 번째 주기 동안 RNA-DNA 듀플렉스의 용융을 향상시키기 때문에 종종 qPCR 응용 분야에 유익합니다.
프라이머 디자인
RT-qPCR에서 qPCR 단계에 사용되는 PCR 프라이머는 이상적으로 증폭 프라이머가 실제 엑손-인트론 경계에 걸쳐 있을 수 있는 엑손-엑손 접합부에 걸쳐 있도록 설계되어야 합니다.인트론 함유 게놈 DNA 서열은 증폭되지 않기 때문에 이 디자인은 오염된 게놈 DNA로 인해 증폭되는 위양성의 위험을 줄입니다.
엑손 또는 엑손-엑손 경계를 분리하도록 프라이머를 설계할 수 없는 경우 RNA 샘플을 RNase-free DNase I 또는 dsDNase로 처리하여 게놈 DNA 오염을 제거해야 할 수 있습니다.
RT-qPCR 제어
역전사 음성 대조군(-RT 대조군)은 DNA 오염(예: 이전 반응의 게놈 DNA 또는 PCR 제품)을 검출하기 위해 모든 RT-qPCR 실험에 포함되어야 합니다.이 컨트롤에는 역전사 효소를 제외한 모든 반응 구성 요소가 포함되어 있습니다.이 컨트롤은 역전사를 일으키지 않기 때문에 PCR 증폭이 관찰되면 DNA 오염일 가능성이 높습니다.
게시 시간: 2022년 8월 2일