다들 qRT-PCR 실험의 원리, 프라이머 디자인, 결과 해석 등을 이야기 하시는데 qRT-PCR의 실험적 조작을 여러분과 공유해야 할 것 같습니다.작지만 결과에 관한 것입니다.
qRT-PCR을 하기 전에 우리 자신의 RNA와 작동 방법에 대한 명확한 이해가 필요합니다.결국 우리의 노력은 단순히 연습하는 것이 아니라 결과를 얻기 위한 것입니다.따라서 qRT-PCR을 수행하기 전에 다음 문제를 확인해야 합니다(일부는 SYBR에만 적용 가능).
1 RNA가 분해되지 않았습니까?
NanoDrop 2000은 RNA의 농도와 순도만 감지할 수 있지만 RNA의 무결성은 감지할 수 없습니다.
RNA(RNA Intesity Number) 값은 Agilent 2100 Bioanalyzer 시스템에서 감지되는 RNA의 무결성을 반영할 수 있습니다.
그림. 다양한 RNA 샘플(진핵생물)에 대한 RIN 값의 개략도
그러나 실험실에는 일반적으로 Agilent 2100 Bioanalyzer가 없습니다.이 경우 formaldehyde gel을 통해서도 검출이 가능하지만 RNA 총량에 대한 요구량이 높기 때문에 가장 빠른 방법은 일반 gel 전기영동을 이용하는 것입니다.뉴클레아제가 없는 환경이어야 하므로 전기영동 탱크, sol 병, 젤 브래킷 및 빗을 DEPC 물로 헹굴 필요가 있습니다.아가로즈도 뉴클레아제가 없으며(새로 개봉한 경우) 로딩 버퍼는 1.2% 젤로 가능한 한 신선하게 개봉해야 합니다.
겔은 완전히 용해되어야 합니다. 그렇지 않으면 그림의 샘플 9와 같이 불균일한 밴드가 생성됩니다.전압이 너무 높거나 너무 오래 실행되면 열이 발생하고 RNA 분해가 발생하므로 전압과 시간을 합리적으로 제어해야 합니다.또한 겔 실행은 샘플에 DNA 잔류물이 있는지 여부를 추가로 확인하고 분배 웰에 많은 수의 밴드가 남아 있는지 관찰할 수 있습니다.
수치.RNA의 겔 전기영동 검출
2 cDNA의 농도에 대해 확신하십니까?
실험실에 있는 큰 형님의 경험에 따르면 각각의 반전으로 얻은 20 ul 시스템의 cDNA는 20X로 직접 희석되는 반면, 박사 후 연구원 자매는 10X로 희석됩니다.나는 보통 상황에 따라 달라집니다.사람마다 언급하는 RNA의 질이 다르기 때문에 반전의 정도도 다르고 반전 기술도 안정적이지 않을 수 있다.
그래서 매번 역방향 cDNA를 얻을 때마다 먼저 3배 정도 희석한 다음 하우스키핑 유전자를 이용하여 RT-PCR을 하는데, 주기는 보통 25주기로 하여 특정 농도를 파악한 다음 최종 희석배수를 결정합니다.
3 프라이머가 사용하기 쉽다고 확신하십니까?
qRT-PCR의 용융 곡선을 통과할 수 있지만 여전히 비용이 듭니다.돈이 많지 않은 실험실의 경우 프라이머가 많이 확보되면 일반 RT-PCR을 이용해 단일 밴드인지 확인하고 프라이머의 특이성을 확인할 수 있다.실험실에 자금이 부족하지 않다면 모든 프라이머의 특이성을 용융 곡선을 통해 한 번에 확인할 수 있습니다.
4 실험 조건이 적합하다고 확신하십니까?
SYBR은 강한 빛으로부터 보호되어야 하므로 SYBR 시약을 추가할 때는 머리 위의 빛을 끄고 희미한 빛만 사용하면 완성됩니다.
4°C에서 SYBR을 보관하십시오.사용시 거품이 생기지 않도록 위아래로 부드럽게 뒤집어 잘 섞이도록 하며, 격렬하게 vortex하지 마십시오.
일부 여동생은 샘플이 섞일까봐 PCR 보드에 표시하는 것을 좋아하는데 이는 잘못된 것입니다.귀하의 마커는 형광 신호 수집에 영향을 미칠 가능성이 매우 높기 때문에 일반적으로 후배들에게 아래와 같이 실험 노트를 사용하여 기억을 보조하도록 권장합니다.
수치.qRT-PCR 샘플 로딩 다이어그램
5 당신이 제대로하고 있다고 확신합니까?
장갑 꼭 끼고, 장갑 끼고, 장갑 끼고, 중요한 말은 세 번 하세요.
SYBR의 빛 노출을 줄이기 위해 개인적으로 아래 그림과 같이 먼저 템플릿을 추가하는 것을 좋아합니다.경험에 따르면 소량의 템플릿을 추가하면 샘플링 오류가 발생할 수 있습니다.따라서 적은 양의 템플릿을 추가하여 발생하는 오류를 최소화하기 위해 보통 샘플을 다시 두 배로 늘리고 샘플을 추가할 때 양을 두 배로 늘려 H2O2 추가량을 줄입니다.
수치.qRT-PCR 로딩의 개략도
그런 다음 qRT-PCR 시스템을 다음과 같이 구성합니다.
수치.qRT-PCR 시스템 준비 다이어그램
참고: 구성 프로세스는 얼음 위에서 수행해야 합니다.
샘플을 넣은 후 투명 밀봉 필름을 붙입니다.투명 실링 필름의 표면을 손으로 만지지 말고 필름의 양쪽 공간에서 조작하십시오.지문도 형광 신호 수집에 영향을 미칠 수 있기 때문입니다.그런 다음 원심분리기를 사용하여 저속으로 10초 동안 빠르게 원심분리기를 사용하여 샘플이 벽에 걸리지 않도록 합니다.
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게시 시간: 2023년 4월 28일
