一、반응계의 감도를 높인다：

1. 고품질 RNA 분리：

성공적인 cDNA 합성은 고품질 RNA에서 나옵니다.고품질 RNA는 적어도 전체 길이여야 하며 EDTA 또는 SDS와 같은 역전사 효소 억제제가 없어야 합니다.RNA의 품질은 cDNA로 전사할 수 있는 최대 서열 정보의 양을 결정합니다.일반적인 RNA 정제 방법은 구아니딘 이소티오시아네이트/산 페놀을 사용하는 원스텝 방법입니다.미량의 RNase에 의한 오염을 방지하려면 RNase가 풍부한 샘플(예: 췌장)에서 분리한 RNA를 특히 장기 보관을 위해 고품질 RNA를 보존하기 위해 포름알데히드에 보관해야 합니다.쥐의 간에서 추출한 RNA는 물에 1주일 정도 보관하면 기본적으로 분해되는 반면, 쥐의 비장에서 추출한 RNA는 물에 3년 보관해도 안정한 상태를 유지했다.또한, 4kb보다 긴 전사체는 작은 전사체보다 미량의 RNase에 의한 분해에 더 민감합니다.저장된 RNA 샘플의 안정성을 높이기 위해 RNA를 탈이온화 포름아미드에 용해하여 -70°C에서 보관할 수 있습니다.RNA를 보존하는 데 사용되는 포름아미드에는 RNA 분해 파편이 없어야 합니다.췌장의 RNA는 적어도 1년 동안 포름아미드에 보존할 수 있습니다.RNA를 사용하기 위해 준비할 때 RNA를 침전시키기 위해 다음과 같은 방법을 사용할 수 있습니다: NaCl을 0.2M, 에탄올의 4배 부피로 첨가하고, 실온에서 3-5분 동안 두고, 10,000×g에서 5분 동안 원심분리합니다.

2. RNaseH-비활성(RNaseH-) 역전사 효소 사용:

RNase 억제제는 종종 역전사 반응에 첨가되어 cDNA 합성의 길이와 수율을 증가시킵니다.RNase 억제제는 cDNA 합성 이전의 과정에서 억제제를 변성시켜 RNA를 분해할 수 있는 결합된 RNase를 방출하기 때문에 완충액 및 환원제(예: DTT)의 존재 하에서 첫 번째 가닥 합성 반응 중에 추가되어야 합니다.Protein RNase inhibitor는 RNase A, B, C에 의한 RNA의 분해만 방지할 뿐, 피부의 RNase는 방지하지 못하므로 이러한 억제제를 사용함에도 불구하고 손가락에서 RNase가 유입되지 않도록 주의하십시오.

역전사 효소는 RNA를 cDNA로 전환하는 것을 촉매합니다.M-MLV와 AMV는 둘 다 그들 자신의 중합효소 활성에 더하여 내인성 RNaseH 활성을 가지고 있습니다.RNaseH 활성과 중합효소 활성은 RNA 주형과 DNA 프라이머 또는 cDNA 연장 가닥 사이에 형성된 하이브리드 가닥을 두고 서로 경쟁하며 RNA:DNA 복합체에서 RNA 가닥을 분해합니다.RNaseH 활성에 의해 분해된 RNA 템플릿은 더 이상 cDNA 합성을 위한 효과적인 기질 역할을 할 수 없으며, 이는 cDNA 합성의 수율과 길이를 감소시킵니다.따라서 역전사효소의 RNaseH 활성을 제거하거나 크게 줄이는 것이 유익할 것입니다.

SuperScript Ⅱ 역전사 효소인 RNaseH- MMLV 역전사 효소와 thermoScript 역전사 효소인 RNaseH-AMV는 MMLV 및 AMV보다 더 많은 양의 full-length cDNA를 얻을 수 있습니다.RT-PCR 민감도는 cDNA 합성량에 영향을 받습니다.ThermoScript는 AMV보다 훨씬 더 민감합니다.RT-PCR 제품의 크기는 특히 더 큰 cDNA를 복제할 때 cDNA를 합성하는 역전사 효소의 능력에 의해 제한됩니다.MMLV와 비교하여 SuperScripⅡ는 긴 RT-PCR 제품의 수율을 크게 높였습니다.RNaseH-역전사효소도 열안정성을 높여 정상인 37~42°C보다 높은 온도에서 반응이 가능하다.제안된 합성 조건에서 올리고(dT) 프라이머와 10 μCi의 [α-P]dCTP를 사용합니다.첫 번째 가닥의 총 수율은 TCA 침전 방법을 사용하여 계산되었습니다.전장 cDNA는 크기별로 분류된 밴드를 잘라내어 알칼리성 아가로즈 겔에서 계수하여 분석했습니다.

3. 역전사를 위해 배양 온도를 높입니다.

더 높은 배양 온도는 RNA 2차 구조를 열어 반응 수율을 높이는 데 도움이 됩니다.대부분의 RNA 템플릿의 경우 RNA와 프라이머를 완충액이나 염 없이 65°C에서 배양한 다음 얼음 위에서 빠르게 냉각하면 대부분의 2차 구조가 제거되고 프라이머가 결합할 수 있습니다.그러나 일부 템플릿은 열 변성 후에도 여전히 2차 구조를 가지고 있습니다.이러한 어려운 템플릿의 증폭은 ThermoScript Reverse Transcriptase를 사용하고 역전사 반응을 더 높은 온도에서 수행하여 증폭을 개선할 수 있습니다.더 높은 배양 온도는 특히 유전자 특이적 프라이머(GSP)가 cDNA 합성에 사용되는 경우 특이성을 증가시킬 수 있습니다(3장 참조).GSP를 사용하는 경우 프라이머의 Tm이 예상 배양 온도와 동일한지 확인하십시오.60°C 이상의 올리고(dT) 및 랜덤 프라이머를 사용하지 마십시오.랜덤 프라이머는 60°C로 올리기 전에 10분 동안 25°C에서 배양해야 합니다.더 높은 역전사 온도를 사용하는 것 외에도 RNA/프라이머 혼합물을 65°C 변성 온도에서 역전사 배양 온도로 직접 옮기고 미리 데운 2X 반응 혼합물을 추가하여(cDNA hot-start 합성) 특이성을 개선할 수도 있습니다.이 접근법은 낮은 온도에서 발생하는 분자간 염기쌍 형성을 방지하는 데 도움이 됩니다.RT-PCR에 필요한 다중 온도 전환은 열 순환기를 사용하여 단순화할 수 있습니다.

Tth 열안정성 중합효소는 Mg2+ 존재 시 DNA 중합효소로 작용하고 Mn2+ 존재 시 RNA 중합효소로 작용합니다.최고 온도 65°C에서 보온이 가능합니다.그러나 PCR 동안 Mn2+의 존재는 충실도를 감소시켜 Tth 중합효소가 cDNA 클로닝과 같은 고정밀 증폭에 적합하지 않게 만듭니다.또한 Tth는 역전사 효율이 낮아 민감도가 떨어지고 역전사 및 PCR이 단일 효소로 가능하기 때문에 오염된 genomic DNA와 cDNA 증폭 산물을 비교하는 데 역전사 없는 제어 반응을 사용할 수 없습니다.증폭 산물을 분리하였다.

4. 역전사 촉진 첨가제：

글리세롤 및 DMSO를 포함한 첨가제가 1차 가닥 합성 반응에 첨가되어 핵산 이중 가닥의 안정성을 감소시키고 RNA의 2차 구조를 풀 수 있습니다.SuperScript II 또는 MMLV 활동에 영향을 주지 않고 최대 20% 글리세롤 또는 10% DMSO를 추가할 수 있습니다.AMV는 또한 활성 손실 없이 최대 20%의 글리세롤을 견딜 수 있습니다.SuperScriptⅡ 역전사 반응에서 RT-PCR의 감도를 극대화하기 위해 10% glycerol을 첨가하여 45°C에서 배양할 수 있습니다.역전사 반응 생성물의 1/10을 PCR에 첨가하면 증폭 반응에서 글리세롤의 농도는 0.4%로 PCR을 억제하기에 충분하지 않다.

5. RNaseH 치료:

PCR 전에 RNaseH로 cDNA 합성 반응을 처리하면 감도를 높일 수 있습니다.일부 템플릿의 경우 cDNA 합성 반응의 RNA가 증폭 산물의 결합을 방지하는 것으로 생각되며, 이 경우 RNaseH 처리가 감도를 높일 수 있습니다.일반적으로 RNaseH 처리는 낮은 복사 결절성 경화증 II와 같은 더 긴 전장 cDNA 표적 주형을 증폭할 때 필요합니다.이 어려운 템플릿의 경우 RNaseH 처리는 SuperScript II 또는 AMV 합성 cDNA에서 생성된 신호를 강화했습니다.대부분의 RT-PCR 반응에서 RNaseH 처리는 선택적입니다. 왜냐하면 95°C에서의 PCR 변성 단계는 일반적으로 RNA:DNA 복합체의 RNA를 가수분해하기 때문입니다.

6. 작은 RNA 검출 방법의 개선：

RT-PCR은 소량의 RNA만 사용할 수 있을 때 특히 어렵습니다.RNA 분리 중에 캐리어로 추가된 글리코겐은 작은 샘플의 수율을 높이는 데 도움이 됩니다.RNase-free 글리코겐은 Trizol을 추가함과 동시에 추가할 수 있습니다.글리코겐은 수용성이며 후속 침전을 돕기 위해 RNA와 함께 수상에 보관될 수 있습니다.50 mg 미만의 조직 또는 106개 배양 세포 샘플의 경우 권장되는 RNase-free 글리코겐 농도는 250 μg/ml입니다.

SuperScript II를 이용한 역전사 반응에 acetylated BSA를 첨가하면 민감도를 높일 수 있으며 소량의 RNA에 대해서는 SuperScript II의 양을 줄이고 RNaseOut nuclease inhibitor 40 unit을 첨가하면 검출 정도를 높일 수 있다.RNA 분리 과정에서 글리코겐을 사용하는 경우 역전사 반응을 위해 SuperScript II를 사용할 때 BSA 또는 RNase 억제제를 추가하는 것이 여전히 권장됩니다.

二, RT-PCR 특이성 증가

1. CND 합성:

첫 번째 가닥 cDNA 합성은 세 가지 다른 방법을 사용하여 시작할 수 있으며, 상대적 특이성은 합성되는 cDNA의 양과 유형에 영향을 미칩니다.

무작위 프라이머 방법은 세 가지 방법 중 가장 특이성이 낮았습니다.프라이머는 전사체 전반에 걸쳐 여러 부위에서 어닐링되어 짧은 부분 길이 cDNA를 생성합니다.이 방법은 5' 말단 서열을 얻고 2차 구조 영역 또는 역전사효소에 의해 복제될 수 없는 종결 부위를 가진 RNA 주형으로부터 cDNA를 얻기 위해 자주 사용됩니다.가장 긴 cDNA를 얻으려면 각 RNA 샘플에서 RNA에 대한 프라이머의 비율을 경험적으로 결정해야 합니다.무작위 프라이머의 시작 농도는 20μl 반응당 50~250ng 범위였습니다.랜덤 프라이머를 사용하여 전체 RNA로부터 합성된 cDNA는 주로 리보솜 RNA이기 때문에 일반적으로 poly(A)+RNA가 주형으로 선택됩니다.

올리고(dT) 프라이머는 랜덤 프라이머보다 더 특이합니다.이것은 대부분의 진핵 mRNA의 3' 말단에서 발견되는 폴리(A) 꼬리에 혼성화합니다.poly(A)+ RNA는 총 RNA의 약 1%~2%이기 때문에 cDNA의 양과 복잡성은 랜덤 프라이머보다 훨씬 적습니다.특이성이 높기 때문에 oligo(dT)는 일반적으로 RNA 대 프라이머의 비율 최적화 및 poly(A)+ 선택이 필요하지 않습니다.20μl reaction system당 0.5μg oligo(dT) 사용을 권장합니다.oligo(dT)12-18은 대부분의 RT-PCR에 적합합니다.ThermoScript RT-PCR 시스템은 더 높은 배양 온도에 대한 더 나은 열 안정성 때문에 oligo(dT)20을 제공합니다.

유전자 특이적 프라이머(GSP)는 역전사 단계에서 가장 특이적인 프라이머입니다.GSP는 모든 RNA에 annealing하는 random primer나 oligo(dT)와 달리 RNA target sequence에 특이적으로 hybridize할 수 있는 antisense oligonucleotide입니다.PCR 프라이머를 설계하는 데 사용되는 동일한 규칙이 역전사 반응에서 GSP 설계에 적용됩니다.GSP는 mRNA의 3'-최말단에 어닐링하는 증폭 프라이머와 동일한 서열일 수 있거나, GSP는 역 증폭 프라이머의 다운스트림을 어닐링하도록 설계될 수 있습니다.일부 증폭 대상의 경우 표적 RNA의 2차 구조가 프라이머 결합을 방해할 수 있기 때문에 성공적인 RT-PCR을 위해 하나 이상의 안티센스 프라이머를 설계해야 합니다.20 μl 첫 번째 가닥 합성 반응에서 1 pmol 안티센스 GSP를 사용하는 것이 좋습니다.

2. 역전사를 위해 배양 온도를 높입니다.

GSP 특이성의 장점을 최대한 활용하기 위해서는 열 안정성이 더 높은 역전사 효소를 사용해야 합니다.내열성 역전사 효소는 반응 엄격도를 높이기 위해 더 높은 온도에서 배양할 수 있습니다.예를 들어, GSP가 55°C에서 어닐링되는 경우 AMV 또는 M-MLV가 37°C의 낮은 엄격도에서 역전사에 사용되는 경우 GSP의 특이성이 완전히 활용되지 않습니다.그러나 SuperScript II 및 ThermoScript는 50°C 이상에서 반응할 수 있으므로 더 낮은 온도에서 생성된 비특정 생성물을 제거합니다.특이성을 최대화하기 위해 RNA/프라이머 믹스를 65°C 변성 온도에서 역전사 배양 온도로 직접 옮기고 예열된 2X 반응 믹스(cDNA 합성 핫 스타트)에 추가할 수 있습니다.이는 저온에서 분자간 염기쌍 형성을 방지하는 데 도움이 됩니다.RT-PCR에 필요한 다중 온도 전환은 열 순환기를 사용하여 단순화할 수 있습니다.

3. 게놈 DNA 오염 감소：

RT-PCR에서 발생할 수 있는 잠재적인 어려움은 RNA에서 게놈 DNA의 오염입니다.Trizol Reagent와 같은 우수한 RNA 분리 방법을 사용하면 RNA 준비를 오염시키는 게놈 DNA의 양을 줄일 수 있습니다.게놈 DNA에서 파생된 제품을 피하기 위해 RNA를 증폭 등급 DNase I로 처리하여 역전사 전에 오염 DNA를 제거할 수 있습니다.DNase I 소화는 샘플을 2.0mM EDTA에서 10분 동안 65°C에서 배양하여 종료되었습니다.EDTA는 마그네슘 이온을 킬레이트화하여 고온에서 마그네슘 이온 의존성 RNA 가수분해를 방지할 수 있습니다.

오염된 게놈 DNA 증폭 산물로부터 증폭된 cDNA를 분리하기 위해, 각각이 분리된 엑손에 어닐링되도록 프라이머를 설계할 수 있습니다.cDNA에서 파생된 PCR 제품은 오염된 게놈 DNA에서 파생된 제품보다 짧습니다.또한 주어진 fragment가 genomic DNA에서 유래한 것인지 cDNA에서 유래한 것인지를 확인하기 위해 각각의 RNA template에 대해 역전사 없는 대조군 실험을 수행했습니다.역전사 없이 얻은 PCR 산물은 게놈에서 파생됩니다.