뉴스 - SARS-CoV-2 핵산 검사 핵심 포인트 종합해석, 위음성과 재검사 양성이 나오는 이유는?

발병 초기에는 급속한 발전으로 의심환자에 대한 신속한 진단이 코로나19 예방의 관건이다.일부 승인된 핵산 검출 시약은 개발 시간이 짧고 성능 확인이 성급하고 시약 최적화가 불충분하며 배치 간 큰 차이가 있는 등의 문제가 있습니다.핵산 검출 프로세스의 다양한 측면에서 다양한 임상 실험실의 문제는 핵산 검출 결과의 정확도에도 영향을 미칠 수 있습니다.이 기사는 현재 SARS-CoV-2 핵산 검출의 핵심 링크 및 포인트에 초점을 맞추고 실험실 핵산 검출 및 임상적 불일치의 위음성 및 양성 재검사 문제를 분석합니다.

SARS-CoV-2 핵산 검출 원리

SARS-CoV-2는 10개의 단백질을 효과적으로 암호화할 수 있는 10개의 유전자를 가진 약 29kb의 게놈 서열을 가진 RNA 바이러스입니다.바이러스는 RNA와 단백질로 구성되어 있으며 가장 바깥층은 지질과 당단백질로 구성된 외피입니다.내부에는 단백질 캡시드가 RNA를 감싸서 쉽게 분해되는 RNA(P1)를 보호합니다.

SARS-COV-2의 P1 구조

바이러스는 특정 세포 표면 수용체를 통해 세포에 침입하여 감염을 일으키고 숙주 세포를 사용하여 복제합니다.

바이러스 핵산 검출의 원리는 세포 용해물을 통해 바이러스 RNA를 노출시킨 후 실시간 형광 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 검출하는 것이다.

검출 원리의 핵심은 프라이머와 프로브를 이용해 핵산 서열의 '표적 매칭', 즉 약 30,000개의 염기(핵산과 다른 바이러스와의 유사성 '낮은' 영역)에서 다른 바이러스와 다른 SARS-CoV-2의 핵산 서열을 찾기 위해 프라이머와 프로브를 설계하는 것이다.

프라이머와 프로브는 SARS-CoV-2 핵산의 특정 영역과 매우 일치합니다. 즉, 특이성이 매우 강합니다.테스트할 샘플의 실시간 형광 RT-PCR 증폭 결과가 양성이면 샘플에 SARS-CoV-2가 존재한다는 것을 증명합니다.P2를 참조하십시오.

SARS-CoV-2 핵산 결정의 P2 단계(실시간 형광 RT-PCR)

SARS-CoV-2 핵산 검출을 위한 실험실의 조건 및 요구 사항

핵산 검사 실험실은 음압 환경에 가장 이상적이며 압력 모니터링에 주의를 기울이고 공기 흐름을 유지하며 에어로졸을 제거해야 합니다.핵산 검사 인력은 상응하는 자격을 갖추어야 하며 관련 중합 효소 연쇄 반응 교육을 받고 평가를 통과해야 합니다.연구실은 엄격하게 관리되고 구역이 지정되어야 하며 관련 없는 직원의 출입은 엄격히 금지됩니다.청결한 지역은 그 자리에서 환기되고 소독되어야 합니다.관련 품목을 구역에 배치하고 깨끗한 것과 더러운 것을 분리하고 적시에 교체하며 제자리에서 오염을 제거합니다.일상적인 소독: 염소 함유 소독제는 더 넓은 지역의 주요 솔루션이며 75% 알코올은 작은 지역에 사용할 수 있습니다.에어로졸을 처리하는 좋은 방법은 환기를 위해 창문을 열어주는 것이며, 공기 소독은 자외선, 여과, 공기 소독을 통해서도 할 수 있습니다.

SARS-CoV-2 핵산 결정의 핵심 링크 및 매개변수(실시간 형광 RT-PCR)

일반적으로 실험실에서는 핵산 "검출"에 세심한 주의를 기울이지만 실제로 핵산 "추출"은 바이러스 샘플의 수집 및 보관과 밀접한 관련이 있는 성공적인 검출을 위한 핵심 단계 중 하나입니다.

현재 가장 널리 사용되는 비인두 면봉과 같은 호흡기 검체는 두 번째 방법인 핵산 추출 및 용해 용액을 기반으로 제조된 불활성화(보존) 용액을 사용합니다.한편으로, 이 바이러스 보존 솔루션은 바이러스의 단백질을 변성시키고 활동을 잃어 더 이상 전염성이 없으며 운송 및 탐지 단계의 안전성을 향상시킬 수 있습니다.반면에 바이러스를 직접 분해하여 핵산을 방출하고 핵산 분해 효소를 제거하며 바이러스를 예방할 수 있습니다.RNA가 분해됩니다.

핵산 추출 용해액을 기반으로 제조된 바이러스 샘플링 용액.주요 성분은 평형염, 에틸렌디아민테트라아세트산 킬레이트제, 구아니딘염(구아니딘 이소티오시아네이트, 구아니딘염산염 등), 음이온성 계면활성제(도데칸 황산나트륨), 양이온성 계면활성제(테트라데실트리메틸암모늄옥살레이트), 페놀, 8-하이드록시퀴놀린, 디티오트레이톨, 프로테이나제 K 및 기타 여러 성분이다.현재 핵산추출키트의 종류는 매우 다양하며, 다양한 핵산추출 및 정제시약을 사용하고 있다.동일한 핵산 추출 및 정제 시약을 사용하더라도 키트마다 추출 절차가 다릅니다.

현재 국가약품감독관리국(National Medical Products Administration)에서 승인한 핵산 검출 키트 제품은 SARS-CoV-2 게놈의 ORF1ab, E 및 N 유전자를 기반으로 선택됩니다.서로 다른 제품의 검출 원리는 기본적으로 동일하지만 프라이머와 프로브 디자인이 다릅니다.단일 표적 세그먼트(ORF1ab), 이중 표적 세그먼트(ORF1ab, N 또는 E) 및 3개 표적 세그먼트(ORF1ab, N 및 E)가 있습니다.검출과 해석, 핵산 추출 및 실시간 형광 RT-PCR 반응 시스템의 차이점은 해당 키트 지침을 참조해야 하며, 사용자는 키트 지침에 명시된 해석 방법을 엄격히 준수하여 해석할 것을 권장합니다.실시간 형광 RT-PCR로 증폭된 공통 영역, 프라이머 및 프로브 서열은 P3에 나와 있습니다.

P3 게놈에서 SARS-CoV-2 앰플리콘 표적의 위치와 프라이머 및 프로브의 서열

SARS-CoV-2 핵산 측정 결과 해석(R얼-Time 형광 RT-PCR)

"SARS-CoV-2 감염에 대한 폐렴 예방 및 통제 계획(제2판)"은 단일 유전자 증폭 결과를 판단하는 기준을 처음으로 명확히 했습니다.

1. Ct가 없거나 Ct≥40은 음수입니다.

2. Ct<37은 양성이고;

3. 37-40의 Ct 값은 그레이 스케일 영역입니다.실험을 반복하는 것이 좋습니다.Ct<40을 재실행한 결과 증폭 곡선에 뚜렷한 피크가 있으면 샘플이 양성으로 판단되고 그렇지 않으면 음성으로 판단됩니다.”

가이드 제3판과 가이드 제4판은 위의 기준을 이어갔다.그러나 상용 키트에 사용되는 타겟이 다르기 때문에 앞서 언급한 가이드 3판에서는 타겟 조합을 결정하는 기준을 제공하지 않았으며 제조업체에서 제공한 지침이 우선함을 강조했습니다.가이드라인 5판부터 두 가지 대상, 특히 판단하기 어려운 단일 대상에 대한 판단 기준을 명확히 했다.즉, 실험실에서 사례가 SARS-CoV-2 핵산 검출에 대해 양성인지 확인하려면 다음 조건 중 하나를 충족해야 합니다.

(1) 동일한 샘플에서 SARS-CoV-2(ORF1ab, N)의 두 표적이 실시간 형광 RT-PCR에 의해 양성으로 테스트되었습니다.단일 대상이 양성인 경우 재샘플링 및 재검사가 필요합니다.테스트 결과가 단일 대상이 여전히 양성이면 양성으로 판단합니다.

(2) 실시간 형광 RT-PCR의 2개 검체가 동시에 단일 표적 양성을 나타내거나 동일한 유형의 2개 검체가 단일 표적 양성인 검사 결과를 나타내어 양성으로 판단할 수 있다.그러나 지침은 또한 핵산 검사의 음성 결과가 SARS-CoV-2 감염을 배제할 수 없음을 강조합니다.검체 품질 불량(구인두 및 기타 부위의 호흡기 검체), 너무 이르거나 너무 늦은 검체 채취, 검체 보관, 운송, 처리 미흡, 기술 자체의 문제(바이러스 변이, PCR 억제) 등 위음성을 유발할 수 있는 요인을 배제해야 합니다.

SARS-CoV-2 탐지에서 거짓 음성의 원인

현재 우려되고 있는 핵산 검사에서의 '위음성' 개념은 핵산 검사 결과가 임상 증상과 일치하지 않는 '위음성' 즉, 코로나19의 임상 증상과 영상 결과가 의심이 많이 되지만 핵산 검사는 항상 '음성'인 경우가 많다.국가위생건강위원회 임상검사센터는 '위음성' SARS-CoV-2 검사에 대해 설명했다.

(1) 감염된 사람의 세포에는 일정량의 바이러스가 있습니다.기존 자료에 따르면 바이러스는 인체에 감염되면 코와 입을 통해 인후로 들어가 기관과 기관지를 거쳐 폐포에 도달한다.감염된 사람은 잠복기, 가벼운 증상, 그리고 심각한 증상의 과정과 질병의 여러 단계를 경험하게 됩니다.그리고 신체의 다른 부분에 존재하는 바이러스의 양이 다릅니다.

세포 유형의 바이러스 부하 측면에서 폐포 상피 세포(하기도)> 기도 상피 세포(상도)> 섬유아세포, 내피 세포 및 대식 세포 등;검체 종류로는 폐포세척액(최우수)>심한기침객담>비인두도말>구인두도말>혈액 순이다.또한 바이러스는 대변에서도 검출될 수 있습니다.그러나 수술의 편리성과 환자의 수용도를 고려하여 일반적으로 사용되는 임상 샘플 순서는 구인두 면봉 > 비인두 면봉 > 기관지 세척액(복합 수술) 및 심부 가래(보통 마른 기침, 입수 곤란)입니다.

따라서 일부 환자의 구인두 또는 비인두 세포에 있는 바이러스의 양이 적거나 극히 적습니다.검사를 위해 구인두 또는 비인두 샘플만 채취하면 바이러스 핵산이 검출되지 않습니다.

(2) 샘플 수집 중에 바이러스 함유 세포가 수집되지 않았거나 바이러스 핵산이 효과적으로 보존되지 않았습니다.

[① 부적절한 채취 부위, 예를 들어 구인두 면봉 채취 시 채취 깊이가 충분하지 않거나, 채취된 비인두 면봉이 비강 깊숙이 채취되지 않는 등 채취된 세포의 대부분은 바이러스가 없는 세포일 수 있습니다.

② 샘플링 면봉을 잘못 사용했습니다.예를 들어, 면봉 헤드의 재질로는 PE 섬유, 폴리에스테르 섬유 및 폴리프로필렌 섬유와 같은 합성 섬유가 권장됩니다.면과 같은 천연 섬유는 실제 작업에 사용됩니다(단백질 흡착력이 강하고 세척이 쉽지 않음).

③ 핵산(DNA/RNA)을 흡수하기 쉬운 폴리프로필렌 또는 폴리에틸렌 플라스틱 저장관의 오용 등 바이러스 저장관의 오용으로 인해 저장액의 핵산 농도가 저하되는 경우.실제로 바이러스 핵산을 저장하기 위해 폴리에틸렌-프로필렌 폴리머 플라스틱과 일부 특수 처리된 폴리프로필렌 플라스틱 용기를 사용하는 것이 좋습니다.]

(4) 임상 검사실 운영이 표준화되지 않았습니다.시료 운송 및 보관 조건, 임상 실험실의 표준화된 운영, 결과 해석 및 품질 관리는 테스트 결과의 정확성과 신뢰성을 보장하는 핵심 요소입니다.국가위생건강위원회 임상검사실에서 2020년 3월 16일~24일에 실시한 외부품질평가 결과에 따르면 유효한 결과를 받은 검사실 844개소 중 701개소(83.1%)가 적격, 143개소(16.9%)가 부적합했다.자격을 갖춘 전체 실험실 테스트 조건은 양호하지만 실험실마다 인력 운영 능력, 단일 표적 양성 샘플 해석 능력 및 품질 관리에 여전히 차이가 있습니다.

SARS-CoV-2 핵산 검출의 위음성을 줄이는 방법은 무엇입니까?

핵산 검출에서 위음성을 줄이는 것은 위음성 생성의 네 가지 측면에서 최적화되어야 합니다.

(1)감염자의 세포에는 일정량의 바이러스가 있다.감염된 것으로 의심되는 사람의 신체 각 부분에 있는 바이러스의 농도는 시간에 따라 다를 것입니다.인두가 없으면 기관지 세척액이나 대변에 있을 수 있습니다.테스트를 위해 여러 유형의 샘플을 동시에 또는 질병 진행의 다른 단계에서 수집할 수 있는 경우 위음성을 방지하는 데 도움이 됩니다.

(2) 검체 채취 시 바이러스가 포함된 세포를 채취하여야 한다.이 문제는 표본 수집가의 교육을 강화함으로써 상당 부분 해결할 수 있습니다.

(3) 신뢰할 수 있는 IVD 시약.국가적 차원에서 시약의 검출 성능 평가에 대한 연구를 수행하고 기존 문제점을 논의함으로써 시약의 검출 효율을 더욱 높이고 분석 감도를 높일 수 있다.

(4) 임상 실험실의 표준화된 운영.실험실 직원의 교육 강화, 실험실 품질 관리 시스템의 지속적인 개선, 합리적인 구분 보장 및 직원 감지 능력 향상을 통해 부적절한 실험실 운영으로 인한 위음성을 줄일 수 있습니다.

회복 및 퇴원 환자의 SARS-CoV-2 핵산 검사 재검사 양성 이유

"COVID-19 진단 및 치료 계획(재판 7판)"에는 COVID-19 환자가 완치되어 퇴원하는 기준 중 하나가 연속된 2개의 호흡기 샘플에서 핵산 검사가 음성(최소 24시간 간격)으로 나왔지만 극소수라는 점을 명확히 규정하고 있습니다. SARS-CoV-2 핵산 검사는 여러 가지 이유로 퇴원 환자에서 다시 양성으로 나왔습니다.

(1)SARS-CoV-2는 새로운 바이러스입니다.병원성 메커니즘, 원인이 되는 질병의 전체 그림 및 질병 경과의 특성을 더 잘 이해할 필요가 있습니다.따라서 한편으로는 퇴원환자에 대한 관리를 강화하고 14일간의 의료관찰을 실시할 필요가 있다.후속 조치, 건강 모니터링 및 건강 지도를 수행하여 질병의 발생, 발달 및 결과의 전체 과정에 대한 이해를 심화합니다.

(2) 환자가 다시 바이러스에 감염될 수 있습니다.학자 Zhong Nanshan은 "완치된 환자는 항체가 있기 때문에 SARS-CoV-2는 다시 침입할 때 항체에 의해 제거될 수 있습니다.여러 가지 이유가 있는데, 이는 회복된 환자의 원인일 수도 있고, 바이러스의 변이와 관련이 있을 수도 있고, 심지어 실험실 검사의 원인일 수도 있습니다.바이러스 자체인 경우 SARS-CoV-2 돌연변이로 인해 회복된 환자가 생산한 항체가 돌연변이 바이러스에 대해 효과가 없을 수 있습니다.환자가 변이된 바이러스에 다시 감염되면 핵산 검사에서 다시 양성이 나올 수 있습니다.

(3) 실험실 테스트 방법에 관한 한 각 테스트 방법에는 한계가 있습니다.SARS-CoV-2 핵산 검출은 유전자 서열의 선택, 시약의 구성, 방법의 민감도 및 기타 이유로 인해 기존 키트가 자체적으로 낮은 검출 한계를 갖게 됩니다.환자가 치료를 받으면 체내 바이러스가 감소합니다.테스트할 샘플의 바이러스 부하가 검출 하한보다 낮으면 "음성" 결과가 나타납니다.그러나 이 결과가 체내 바이러스가 완전히 사라진 것은 아니다.바이러스는 치료가 중단된 후일 수 있습니다.부활”, 계속 복사하십시오.따라서 퇴원 후 2~4주 이내에 주 1회 복습하는 것이 좋습니다.

(4) 핵산은 바이러스의 유전 물질이다.환자가 항바이러스제 치료를 받으면 바이러스는 사멸하지만, 남은 바이러스 RNA 조각은 여전히 인체에 남아 있어 몸 밖으로 완전히 배출되지 않는다.경우에 따라 특정 상황에서 더 많이 보유할 수 있습니다.오랜 시간이 걸리고 이때 핵산 테스트는 "일시적" 양성이 될 것입니다.환자의 회복 시간이 길어짐에 따라 체내에 남아있는 RNA 조각이 점차 고갈된 후 핵산 검사 결과가 음성으로 나올 수 있습니다.

(5) SARS-CoV-2의 핵산검사 결과는 바이러스 RNA의 유무만을 증명할 뿐, 바이러스의 활동성과 바이러스 전파 여부를 증명할 수 없다.핵산 검사에서 다시 양성 판정을 받은 환자가 다시 감염원이 될 수 있는지 입증해야 한다.임상 검체를 대상으로 바이러스 배양을 진행하고 감염성이 있음을 증명하기 위해 "살아있는" 바이러스를 배양해야 합니다.

요약

요약하면, SARS-CoV-2 핵산 검사 위음성, 재검사 양성 및 임상 증상과 일치하지 않는 기타 조건을 완전히 피할 수는 없습니다.실제 선별 및 검사 시에는 임상증상, 영상검사(CT), 실험적 검사실 검사(핵산검사 + 바이러스 특이항체검사) 결과를 종합적으로 종합적으로 진단하여 오진 및 오진을 예방하는 것이 좋습니다.검사 결과가 임상 증상과 명백히 일치하지 않는 것으로 밝혀지면 전체 검사 링크(샘플 수집, 순환 및 처리 링크)에 대한 종합 분석을 수행하여 SARS-CoV-2 바이러스 초기 감염, 재발성 감염 또는 다른 호흡기 바이러스 감염 가능성 등을 배제하는 것이 좋습니다.조건이 허락하는 경우 재검사를 위해 가래 또는 폐포 세척액과 같은 보다 민감한 샘플을 수집하는 것이 좋습니다.

게시 시간: 2021-09-03