PCR 시약의 초기 단계에서 프라이머와 프로브의 성능을 검증하고 가장 적합한 반응 조건을 결정하는 것은 정식 실험의 원활한 진행을 보장하기 위한 전제 조건입니다.
그렇다면 초기 단계에서 프라이머 프로브를 어떻게 확인해야 할까요?
주요 지표는 기준선, 증폭 곡선, ct 값, 증폭 효율, 저농도 시료 검출, CV 등입니다.
기준선
기준선은 PCR 증폭 곡선의 수평선입니다.PCR 증폭 반응의 처음 몇 사이클에서는 형광 신호가 크게 변하지 않고 직선을 형성합니다.이 직선이 기준선입니다.
PCR 프라이머 프로브를 스크리닝할 때 기준선이 수평인지 여부에 주의하십시오.프라이머 프로브 농도의 순도는 기준선이 오르거나 내리는 등 기준선에 영향을 미칩니다.기준선은 또한 매우 직관적인 지표입니다.
증폭 곡선
또 다른 직관적인 지표는 증폭 곡선의 모양입니다.2차 증폭이나 기타 비정상적인 증폭 곡선을 피하기 위해 S자 곡선을 갖는 것이 가장 좋습니다.
Ct 값
기준선에서 지수 성장까지의 변곡점에 해당하는 주기 수가 Ct 값입니다.
동일한 샘플에 대해 서로 다른 프라이머 프로브는 서로 다른 증폭 곡선을 생성하며 해당 Ct 값은 증폭 효율과 간섭 정도의 영향을 받습니다.이론적으로 우리가 선택한 프라이머 프로브의 Ct 값이 작을수록 좋습니다.
증폭 효율
PCR 증폭 효율을 평가하는 가장 신뢰할 수 있고 안정적인 방법 중 하나는 표준 곡선이며, 이는 연구자들도 널리 인정하고 있습니다.이 방법에는 대상 템플릿의 상대적 수를 제어하기 위해 일련의 샘플을 만드는 작업이 포함됩니다.이러한 샘플은 일반적으로 농축 원액의 연속 희석으로 만들어지며 가장 일반적으로 사용되는 것은 10배 희석입니다.일련의 희석된 샘플을 사용하여 표준 qPCR 프로그램을 사용하여 증폭하여 Cq 값을 얻고 최종적으로 각 샘플의 농도와 해당 Cq 값에 따라 표준 곡선을 그려 선형 방정식 Cq= -klgX0+b 및 증폭 효율 E=10(-1 /k)-1을 얻습니다.정량 분석을 위해 qPCR을 사용할 때 증폭 효율은 90%-110%(3.6>k>3.1) 범위여야 합니다.
저농도 샘플 검출
샘플 농도가 낮을 때 다른 프라이머 프로브의 검출 속도가 다릅니다.20개의 저농도 샘플을 선택하여 복제하며 검출률이 가장 높은 프라이머-프로브 시스템이 가장 좋습니다.
변동 계수(CV)
핵산 증폭 검출용 시약의 라인 규격에 따라 서로 다른 프라이머 프로브로 10개의 중복 샘플을 검출할 수 있습니다.
정량 시약:
정확성
한 배치 내의 정확도는 다음을 충족해야 합니다. 테스트 농도의 대수 값의 변동 계수(CV,%)는 ≤5%입니다.검체농도가 낮을 때 검출농도 대수의 변동계수(CV,%)는 ≤10%
정성적 시약:
정확성
한 배치 내의 정확도는 다음을 충족해야 합니다.
(1) Ct 값의 변동 계수(CV,%) ≤5%
동일한 샘플을 10회 병렬로 테스트하고 테스트 결과가 일관되어야 합니다.
게시 시간: 2021년 9월 18일
