직접 PCR은 핵산 추출 없이 증폭을 위해 동식물 조직을 직접 이용하는 반응이다.여러 가지 면에서 직접 PCR은 일반 PCR과 동일하게 작동합니다.

주요 차이점은 직접 PCR에 사용되는 맞춤 버퍼이며, 시료는 핵산 추출 없이 PCR 반응에 직접 적용할 수 있지만 직접 PCR 반응과 관련된 버퍼의 호환성 및 효소의 내성에 대한 해당 요구 사항이 있습니다.

일반적인 샘플에는 PCR 억제제가 더 많거나 적지만 직접 PCR은 여전히 ​​효소와 버퍼의 작용 하에서 신뢰할 수 있는 증폭을 달성할 수 있습니다.기존의 PCR 반응은 고품질의 핵산을 주형으로 해야 하는데, 주형에 단백질 및 기타 불순물이 포함되어 있을 경우 PCR 반응의 원활한 진행을 방해할 수 있습니다.직접 PCR은 현재 분자 진단 분야에서 가장 많이 사용되는 기술 중 하나입니다.

01 Direct PCR은 원래 동물과 식물에 사용되었습니다.

직접 PCR의 초기 응용 분야는 쥐, 고양이, 닭, 토끼, 양, 소 등의 혈액, 조직 및 털, 식물 잎 및 종자 등과 같은 동물 및 식물 분야에서 유전형, 형질 전환, 플라스미드 검출, 유전자 녹아웃 분석, DNA 소스 식별, 종 식별, SNP 분석 및 기타 분야를 연구하는 데 사용됩니다.

이러한 필드에는 몇 가지 공통된 특징이 있습니다. 즉, 표적 유전자 함량이 상대적으로 높고 핵산 추출이 번거롭기 때문에 직접 PCR은 시간을 절약하고 결과에 작은 영향을 미칠 뿐만 아니라 비용도 절약할 수 있습니다.

병원체 검출에 사용되는 직접 PCR은 최근 몇 년 동안의 문제이며 일부 PCR 시약 제조업체는 혁신을 할 때 이러한 방향으로 많은 노력을 기울였습니다.특히 이번 COVID-19 전염병에서 Foregene이 연구하고 개발한 SARS-CoV-2 핵산 검출 키트(Multiplex PCR Fluorescent Probe Method)와 같은 많은 검출 제품이 시장에 등장했습니다. 이 키트는 인간 비인두 또는 구강인두 면봉 샘플에서 SARS-CoV-2 핵산의 정성적 검출을 위해 실시간 RT PCR 기술(rRT-PCR)을 사용합니다.

Foregene은 정상 ORF1ab, N, E 및변종 SARS-CoV-2 B.1.1.7 계통(UK), B.1.351 계통(ZA), B.1.617 계통(IND) 및 P.1 계통(BR)과 같은 인간 비인두 또는 구강인두 면봉 샘플의 핵산 계통.

02  직접 PCR에 필요한 시약

샘플 용해물

샘플 용해물은 직접 구성하거나 구매할 수 있습니다.다른 브랜드의 lysate 구성의 차이는 lysing 능력을 다르게 만들 것이며 lysing 시간은 약간 다를 것입니다.예를 들어, 동물 조직 샘플의 준비를 위해 일반적으로 30분 또는 밤새 lysis가 권장되며 바이러스에 대한 lysis 솔루션은 3-10분 범위입니다.

PCR 마스터 믹스

특정 증폭을 강화하고 증폭 능력을 높이려면 hot-start DNA polymerase를 사용하는 것이 좋습니다.직접 PCR의 핵심은 내성이 강한 중합효소입니다.

DNA 증폭에 영향을 미치는 샘플의 성분 제거 또는 억제

샘플이 용해물로 처리된 후 단백질, 지질 및 기타 세포 파편이 방출되며 이러한 물질은 PCR 반응을 억제합니다.따라서 직접 PCR은 이러한 요인의 영향을 줄이기 위해 해당 제거 또는 억제제를 추가해야 합니다.

03  Direct PCR의 5가지 지식 포인트 모음

첫째, Direct PCR 기술은 다양한 생물학적 시료에 대한 직접 PCR 기술입니다.이러한 기술적 조건에서는 핵산을 분리 및 추출할 필요가 없으며, 조직 샘플을 직접 목적물로 사용하고 표적 유전자 프라이머를 추가하여 PCR 반응을 수행할 수 있습니다.

둘째, Direct PCR 기술은 기존의 DNA template 증폭 기술뿐만 아니라 RNA template 역전사 PCR도 포함합니다.

셋째, Direct PCR 기술은 조직 샘플에 대한 일상적인 정성적 PCR 반응을 직접 수행할 뿐만 아니라 Real-Time qPCR 반응도 포함하는데, 이는 반응 시스템이 강력한 배경 형광 간섭 기능을 가지고 있어야 하고 내인성 형광이 길항 능력을 소멸시켜야 합니다.

넷째, Direct PCR 기술의 대상이 되는 시료는 핵산 주형의 방출만 필요하며, PCR 반응을 방해하는 단백질, 다당류, 염 이온 등은 제거하지 않습니다.복잡한 조건에서 효소 활성 및 복제 정확도를 보장하기 위해 반응 시스템의 핵산 중합 효소 및 PCR Mix가 우수한 저항성과 적응성을 요구합니다.

다섯째, 핵산 농축 처리 없이 직접 PCR 기술로 표적화된 조직 시료와 주형의 양이 매우 적기 때문에 반응 시스템의 감도와 증폭 효율이 매우 높아야 합니다.