Ct 값은 형광 정량 PCR의 가장 중요한 결과 제시 형태입니다.유전자 발현 차이 또는 유전자 복제 수를 계산하는 데 사용됩니다.그렇다면 합리적인 것으로 간주되는 형광 정량화의 Ct 값은 얼마입니까?Ct 값의 유효 범위를 보장하는 방법은 무엇입니까?

Ct 값이란 무엇입니까?
qPCR 증폭 과정에서 증폭된 산물의 형광 신호가 설정된 형광 임계값에 도달할 때 해당 증폭 주기(Cycle Threshold) 수.C는 주기를 나타내고 T는 임계값을 나타냅니다.간단히 말해, Ct 값은 초기 템플릿 증폭이 qPCR에서 일정량의 제품에 도달하는 시점에 해당하는 사이클 수입니다.소위 "일정량 제품"에 대해서는 나중에 자세히 설명합니다.

Ct 값은 무엇을 합니까?

1. 지수 증폭, 템플릿 양 및 Ct 값의 관계
이상적으로, qPCR의 유전자는 특정 수의 주기 후에 지수적 증폭에 의해 축적됩니다.증폭 사이클 수와 산물량의 관계는 증폭 산물량 = 초기 템플릿량 × (1+En) 사이클 수이다.그러나 qPCR 반응이 항상 이상적인 상황에 있는 것은 아닙니다.증폭된 산물의 양이 "특정 산물량"에 도달하면 이때의 사이클 수가 Ct 값이며 지수 증폭 기간에 있습니다.Ct 값과 시작 템플릿 양 사이의 관계: 템플릿의 Ct 값과 템플릿 시작 사본 수의 로그 사이에는 선형 관계가 있습니다.초기 템플릿 농도가 높을수록 Ct 값이 작아집니다.초기 템플릿 농도가 낮을수록 Ct 값이 커집니다.

2. 증폭 곡선, 형광 역치 및 특정 PCR 생성물 양
qPCR 증폭 산물의 양은 형광 신호, 즉 증폭 곡선의 형태로 직접 표시됩니다.PCR의 초기 단계에서는 증폭이 이상적인 조건에 있고, 사이클 수가 적고, 생성물 축적이 적고, 형광 수준이 형광 배경과 명확하게 구별되지 않습니다.그 후, 형광이 증가하고 지수 단계에 들어갑니다.PCR 산물의 양은 PCR 반응이 막 지수기에 있을 때 특정 시점에서 감지할 수 있으며, 이를 "산물의 일정량"이라고 할 수 있으며, 이로부터 템플릿의 초기 함량을 유추할 수 있습니다.따라서 일정량의 제품에 해당하는 형광 신호 강도가 형광 임계값입니다.

PCR 후기 단계에서 증폭 곡선은 더 이상 기하급수적 증폭을 나타내지 않고 선형 단계 및 고원 단계에 들어갑니다.

3.Ct 값의 재현성
PCR 주기가 Ct 값의 주기 수에 도달하면 진정한 지수 증폭 주기에 막 진입한 것입니다.이때 작은 오차가 증폭되지 않아 Ct값의 재현성이 우수하다.증폭, 얻어진 Ct 값은 일정합니다.

1. 증폭 효율 En
PCR 증폭 효율은 중합효소가 증폭하고자 하는 유전자를 앰플리콘으로 전환시키는 효율을 말한다.하나의 DNA 분자가 두 개의 DNA 분자로 변형될 때 증폭 효율은 100%입니다.증폭 효율은 일반적으로 En으로 표현됩니다.후속 기사의 분석을 용이하게 하기 위해 증폭 효율에 영향을 미치는 요인을 간략하게 소개합니다.

2.Ct 값의 범위
Ct 값의 범위는 15-35입니다.Ct 값이 15 미만이면 증폭이 기준 주기 범위 내에 있고 형광 임계값에 도달하지 않은 것으로 간주됩니다.이상적으로는 Ct 값과 템플릿의 초기 사본 수의 로그, 즉 표준 곡선 사이에 선형 관계가 있습니다.표준 곡선을 통해 증폭 효율이 100%일 때 유전자의 single copy 수를 정량화하기 위한 계산된 Ct 값은 약 35입니다. 35보다 크면 template의 초기 copy 수는 이론적으로 1보다 작아 의미가 없다고 볼 수 있습니다.

다른 유전자 Ct 범위에 대해서는 초기 템플릿 양의 유전자 복제 수와 증폭 효율의 차이로 인해 유전자에 대한 표준 곡선을 만들고 유전자의 선형 검출 범위를 계산해야 합니다.

3.Ct 값의 영향 요인
증폭 사이클의 수와 산물의 양 사이의 관계로부터: 증폭된 산물의 양 = 초기 템플릿의 양 × (1+En) 사이클 수, 이상적인 조건에서 초기 템플릿의 양과 En이 Ct 값에 부정적인 영향을 미칠 것이라는 것을 알 수 있습니다.템플릿 품질 또는 증폭 효율의 차이로 인해 Ct 값이 너무 크거나 작습니다.

4.Ct 값이 너무 크거나 작습니다.