PCR은 가장 널리 사용되는 핵산 증폭 기술로 민감도와 특이도 때문에 널리 사용되고 있다.그러나 PCR은 반복적인 열변성을 필요로 하고 기기 및 장비에 의존하는 한계를 없앨 수 없어 임상 현장 시험에서의 적용에 한계가 있다.

1990년대 초부터 많은 실험실에서 열 변성이 필요하지 않은 항온 증폭 기술을 개발하기 시작했습니다.이제 그들은 루프 매개 등온 증폭 기술, 가닥 교체 등온 증폭 기술, 롤링 서클 등온 증폭 기술 및 핵산 서열 의존성을 개발했습니다.등온 증폭 기술 및 기타 기술. 

Loop 매개 등온 증폭

증폭 원리는 DNA가 약 65°C에서 동적 평형 상태에 있다는 사실에 근거합니다.프라이머가 염기쌍을 이루고 이중 가닥 DNA의 상보적인 부분으로 확장되면 다른 가닥이 분리되어 단일 가닥이 됩니다.

이 온도에서 DNA는 4개의 특정 프라이머를 사용하여 가닥 변위 DNA 폴리머라아제에 의존하여 가닥 변위 DNA 합성이 지속적으로 자체 순환되도록 합니다.

먼저 타겟 유전자에서 6개의 특정 영역 F3, F2, F1, B1, B2, B3를 결정한 다음 이 6개의 특정 영역을 기반으로 4개의 프라이머를 디자인합니다(아래 그림 참조).

전방 내부 프라이머(FIP)는 F1c와 F2로 구성됩니다.

BIP(Backward Inner Primer)는 B1c와 B2로 구성되어 있고 중간에 TTTT가 스페이서로 사용됩니다.

외부 프라이머 F3 및 B3은 각각 표적 유전자 상의 F3 및 B3 영역으로 구성된다.

LAMP 반응 시스템에서 내부 프라이머의 농도는 외부 프라이머의 몇 배입니다.내부 프라이머는 먼저 주형 가닥과 결합하여 상보 가닥을 합성하여 DNA 이중 가닥을 형성합니다.그 후, 외부 프라이머는 주형 가닥과 결합하여 DNA 이중 가닥을 형성합니다.BstDNA 중합효소의 작용으로 내부 프라이머에 의해 합성된 상보 가닥이 방출됩니다.일련의 반응 후에 상보적인 가닥은 마침내 아령 구조를 가진 단일 DNA 가닥을 형성합니다.

아령 구조 DNA 단일 가닥 자체가 주형으로 사용되어 끝이 열린 전이 줄기-고리 구조 DNA를 연속적으로 형성합니다.내부 및 외부 프라이머는 전이 스템-루프 구조 DNA가 연속적으로 가닥 치환 및 확장 반응을 겪도록 안내하고 최종적으로 길이가 다른 여러 스템-루프 구조를 형성합니다.DNA 혼합물.

루프 매개 등온 증폭의 장단점

램프의 장점:

(1) 높은 증폭 효율로 1시간 이내에 target 유전자의 1-10 copy를 효과적으로 증폭할 수 있으며 증폭 효율은 일반 PCR의 10-100배입니다.

(2) 반응시간이 짧고 특이성이 강하며 특별한 장비가 필요하지 않다.

램프의 단점:

(1) 프라이머에 대한 요구 사항이 특히 높습니다.

(2) 증폭된 산물은 cloning 및 sequencing에 사용할 수 없으며, 판단용으로만 사용할 수 있습니다.

(3) 감도가 높기 때문에 에어로졸을 형성하기 쉬우므로 위양성을 유발하고 검사 결과에 영향을 미칩니다.

S추세 변위 증폭

Strand displacement amplification(SDA)은 1992년 미국의 Walker가 처음 제안한 효소 반응에 기초한 in vitro 등온 DNA 증폭 기술입니다.

SDA의 기본 시스템에는 제한 엔도뉴클레아제, 가닥 치환 활성을 갖는 DNA 중합효소, 두 쌍의 프라이머, dNTP, 칼슘 및 마그네슘 이온 및 완충 시스템이 포함됩니다.

가닥 치환 증폭의 원리는 표적 DNA의 양 말단에 화학적으로 변형된 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 기반으로 합니다.엔도뉴클레아제는 인식 부위에서 가닥 DNA의 틈을 열고, DNA 중합효소는 틈을 3' 끝으로 확장하고 다음 DNA 가닥을 대체합니다.

교체된 DNA의 단일 가닥은 프라이머와 결합되어 DNA 중합효소에 의해 이중 가닥으로 확장될 수 있습니다.이 과정을 지속적으로 반복하여 표적 염기서열을 효율적으로 증폭시킨다.

가닥 변위 증폭 기술의 장단점

SDA의 장점:

증폭 효율이 높고 반응 시간이 짧으며 특이성이 강하고 특별한 장비가 필요하지 않습니다.

SDA의 단점:

제품이 균일하지 않고 일부 단일 가닥 및 이중 가닥 제품은 SDA 사이클에서 항상 생산되며 전기 영동으로 감지하면 필연적으로 테일링이 발생합니다.

R올링 서클 증폭

롤링 서클 증폭(Rolling circle amplification, RCA)은 롤링 서클에 의해 병원성 유기체로부터 DNA를 복사하는 방법에 착안하여 제안된다.일정한 온도에서 단일 가닥 원형 DNA를 주형으로 사용하고 특수 DNA 폴리머라제(예: Phi29)를 사용하여 롤링 서클 DNA 합성을 수행하여 표적 유전자의 증폭을 달성합니다.

RCA는 선형 증폭과 지수 증폭으로 나눌 수 있습니다.선형 RCA의 효율성은 10에 도달할 수 있습니다.⁵시간, 지수 RCA의 효율성은 10에 도달할 수 있습니다.⁹타임스.

간단한 구분은 아래 그림과 같이 선형 증폭 a는 1개의 프라이머만 사용하고 지수 증폭 b는 2개의 프라이머를 사용합니다.

선형 RCA는 단일 프라이머 RCA라고도 합니다.프라이머는 원형 DNA에 결합하고 DNA 중합효소의 작용에 의해 확장됩니다.이 제품은 단일 루프 길이의 수천 배에 달하는 반복 시퀀스가 ​​많은 수의 선형 단일 가닥입니다.

선형 RCA의 산물은 시작 프라이머에 항상 연결되어 있기 때문에 신호의 고정이 용이한 것이 큰 장점입니다.

Hyper branched amplification HRCA(Hyper branched RCA)로도 알려진 지수형 RCA는 지수형 RCA에서 하나의 프라이머가 RCA 산물을 증폭하고, 두 번째 프라이머가 RCA 산물과 혼성화되어 확장되며, 대체물은 이미 RCA 산물에 결합되어 있습니다. 다운스트림 프라이머는 가닥을 확장하고 확장 및 교체를 반복하여 수지상 RCA 증폭 산물을 생성합니다.

롤링 서클 핵산 증폭의 장단점

RCA의 장점:

높은 감도, 우수한 특이성 및 쉬운 조작.

RCA의 단점:

신호 감지 중 배경 문제.RCA 반응 동안 순환되지 않은 자물쇠 프로브와 결합되지 않은 프로브의 주형 DNA 또는 RNA는 일부 배경 신호를 생성할 수 있습니다. 

N핵산 서열 기반 증폭

NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification)는 PCR을 기반으로 개발된 새로운 기술입니다.이것은 T7 프로모터 서열이 있는 한 쌍의 프라이머에 의해 안내되는 연속적이고 등온적인 핵산 증폭입니다.이 기술은 주형 RNA를 약 2시간 만에 약 109배 증폭할 수 있어 기존 PCR 방식보다 1000배 이상 증폭이 가능하고 특별한 장비가 필요하지 않다.

이 기술은 질병의 출현과 동시에 신속한 진단에 활용되었으며, 현재 많은 기업에서 RNA 검출키트에 이 방법을 활용하고 있다.

RNA 증폭도 역전사 PCR 기술을 사용할 수 있지만 NASBA에는 고유한 장점이 있습니다. 상대적으로 일정한 온도 조건에서 수행할 수 있고 기존 PCR 기술보다 더 안정적이고 정확합니다.

반응은 섭씨 41도에서 이루어지며 AMV(조류 골수모세포증 바이러스) 역전사효소, RNase H, T7 RNA 중합효소 및 한 쌍의 프라이머가 필요합니다.

프로세스에는 주로 다음이 포함됩니다.

정방향 프라이머는 T7 프로모터의 상보적 서열을 포함합니다.반응 중에 정방향 프라이머는 RNA 가닥에 결합하고 AMV 효소에 의해 촉매되어 DNA-RNA 이중 가닥을 형성합니다.

RNase H는 하이브리드 이중 가닥의 RNA를 분해하고 단일 가닥 DNA를 유지합니다.

리버스 프라이머와 AMV 효소의 작용으로 T7 프로모터 서열을 포함하는 DNA 이중 가닥이 형성됩니다.

T7 RNA 중합효소의 작용으로 전사 과정이 완료되고 많은 양의 표적 RNA가 생성됩니다.

NASBA의 장점:

(1) 프라이머는 T7 프로모터 서열을 가지고 있으나 외래 이중나선 DNA는 T7 프로모터 서열이 없어 증폭이 불가능하여 특이성과 민감도가 높은 기술이다.

(2) NASBA는 역전사 과정을 증폭 반응에 직접 통합하여 반응 시간을 단축시킵니다.

NASBA의 단점:

(1) 반응 성분이 더 복잡하다.

(2) 반응 비용을 높이려면 세 종류의 효소가 필요하다.