COVID-19는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2형에 의해 발생하는 전염병입니다. 사람이 감염되면 가장 흔한 증상은 발열, 기침, 호흡곤란입니다.

검사에 사용되는 샘플은 비인두 면봉 또는 구인두 면봉으로 수집할 수 있습니다.

PCR이란 무엇입니까?

코로나 바이러스 검출의 표준 방법은 중합 효소 연쇄 반응, PCR입니다.이것은 분자 생물학에서 널리 사용되는 방법입니다.수백만에서 수십억 개의 특정 DNA 조각을 빠르게 복사할 수 있습니다.

새로운 코로나바이러스는 매우 긴 단일 가닥 RNA 게놈을 포함합니다.이러한 바이러스를 PCR로 검출하기 위해서는 RNA 분자가 역전사효소에 의해 상보적인 DNA 서열로 변환되어야 하며, 새로 합성된 DNA는 일반적으로 RT-PCR로 알려진 표준 PCR 절차로 증폭될 수 있습니다.

RT-PCR 과정

RNA 추출

이 방법을 수행하기 위해서는 기본적으로 바이러스 RNA가 추출되어야 합니다.편리하고 빠르고 효과적인 분리를 위해 다양한 RNA 정제 키트를 사용할 수 있습니다.

상용 키트를 사용하여 바이러스 RNA를 추출하려면 먼저 샘플을 마이크로 원심 분리기 튜브에 추가한 다음 용해 버퍼와 혼합합니다.이 완충액은 고도로 변성되었으며 일반적으로 페놀과 구아니딘 이소티오시아네이트로 구성됩니다.또한 RNase 억제제는 일반적으로 온전한 바이러스 RNA의 분리를 보장하기 위해 용해 완충액에 존재합니다.

용해 버퍼를 추가한 후, 혼합 튜브를 펄스로 vortex하고 실온에서 배양합니다.그런 다음 바이러스는 용해 완충액이 제공하는 고도의 변성 조건에서 용해됩니다.

샘플이 용해된 후 원심분리기 튜브가 정제 절차에 사용됩니다.시료를 원심분리기 튜브에 넣은 다음 원심분리합니다.

이 절차는 고정상이 실리카겔 매트릭스로 구성된 고체상 추출 방법입니다.

최적의 염 및 pH 조건에서 RNA 분자는 실리카 막에 결합합니다.

동시에 단백질 및 기타 오염 물질이 제거됩니다.

원심분리 후 깨끗한 collection tube에 centrifuge tube를 넣고 여과액을 버리고 washing buffer를 넣는다.

멤브레인을 통해 세척 버퍼를 강제로 다시 원심 분리기에 튜브를 놓습니다.이렇게 하면 멤브레인에서 남아 있는 모든 불순물이 제거되고 실리카겔에 결합된 RNA만 남게 됩니다.

샘플을 세척한 후 튜브를 깨끗한 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 용출 버퍼를 추가합니다.

그런 다음 멤브레인을 통해 용출 완충액을 강제로 원심분리합니다.용출 버퍼는 스핀 컬럼에서 바이러스 RNA를 제거하고 단백질, 억제제 및 기타 오염 물질이 없는 정제된 RNA를 얻습니다.

2 단계

혼합농축액

바이러스 RNA를 추출한 후 다음 단계는 PCR 증폭을 위한 반응 혼합물을 준비하는 것입니다.이 단계에서는 농축액이 사용됩니다.이 농축 용액은 프리믹스, 역전사 효소, 뉴클레오티드, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, TaqMan 프로브 및 DNA 중합효소로 구성된 미리 혼합된 농축 용액입니다.

마지막으로, 이 반응 혼합물을 완성하기 위해 RNA 템플릿이 추가됩니다.튜브는 펄스 보텍싱에 의해 혼합된 다음 반응 혼합물이 PCR 플레이트에 로드됩니다.PCR 플레이트는 일반적으로 96개의 웰을 포함하며 동시에 여러 샘플을 분석할 수 있습니다.

3단계

PCR 증폭

다음으로, 본질적으로 열 순환기인 PCR 기계에 플레이트를 놓습니다.

실시간 RT-PCR은 RdrRP 유전자, E 유전자 및 N 유전자의 표적 서열을 증폭하여 2019년 신종 코로나바이러스를 검출하는 데 사용됩니다.표적 유전자의 선택은 프라이머 및 프로브 서열에 따라 다릅니다.

RT-PCR의 첫 번째 단계는 역전사입니다.바이러스 RNA 게놈의 상보적인 부분에 결합하는 PCR 역방향 프라이머에 의해 개시되는 상보적 DNA의 첫 번째 가닥이 합성됩니다.그런 다음 역전사 효소는 바이러스 RNA에 상보적인 DNA를 합성하기 위해 프라이머의 3' 말단에 DNA 뉴클레오티드를 추가합니다.이 단계의 온도와 기간은 사용된 프라이머, 표적 RNA 및 역전사 효소에 따라 다릅니다.

다음으로 초기 변성 단계가 적용되어 RNA-DNA 하이브리드가 변성됩니다.이 단계는 DNA 중합 효소를 활성화하는 데 필요합니다.동시에 역전사 효소가 비활성화됩니다.

PCR은 일련의 열 주기로 구성됩니다.각 주기는 변성, 어닐링 및 확장 단계로 구성됩니다.

변성 단계는 반응 챔버를 섭씨 95도까지 가열하고 이중 가닥 DNA 템플릿의 변성을 위해 사용하는 것을 포함합니다.

다음 단계에서는 반응 온도를 섭씨 58도로 낮추어 정방향 프라이머가 단일 가닥 DNA 주형의 상보적인 부분에 어닐링하도록 합니다.어닐링 온도는 프라이머의 길이와 구성에 직접적으로 의존합니다.

연장 단계에서 DNA 중합효소는 DNA 주형 가닥에 상보적인 새로운 DNA 가닥을 합성합니다.반응 혼합물에서 5'에서 3' 방향으로 주형에 상보적인 자유 핵을 추가합니다.이 단계의 온도는 사용된 DNA 중합효소에 따라 다릅니다.

첫 번째 주기 후 이중 가닥 DNA 표적을 얻습니다.

그런 다음 두 번째 주기에 들어갑니다.이중 가닥 DNA는 변성되어 두 개의 단일 가닥 DNA 분자를 생성합니다.

다음 단계에서는 반응 온도를 낮추고 프라이머를 각 단일 가닥 DNA 주형에 어닐링하고 Taq-man 프로브를 표적 DNA의 상보적인 부분에 어닐링합니다.

TaqMan 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브의 5' 말단에 공유 결합된 형광단으로 구성됩니다.사이클러의 광원에 의해 여기되면 형광단이 형광을 방출합니다.또한 프로브는 3' 말단에 소광제로 구성되어 있습니다.소광제에 대한 리포터 유전자의 근접성은 형광 검출을 방지합니다.

연장 단계에서 DNA 중합효소는 새로운 가닥을 합성합니다.중합효소가 TaqMan 탐침에 도달하면 내인성 5'뉴클레아제 활성이 탐침을 절단하여 소광제에서 염료를 분리합니다.

PCR의 각 주기마다 더 많은 염료 분자가 방출되어 합성된 앰플리콘의 수에 비례하여 형광 강도가 증가합니다.

이 방법을 사용하면 샘플에 있는 주어진 시퀀스의 수를 추정할 수 있습니다.이중 가닥 DNA 조각의 수는 각 주기에서 두 배가 됩니다.따라서 PCR은 매우 작은 샘플을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

형광 신호 측정을 위해 텅스텐 할로겐 램프, 여기 필터, 반사경, 렌즈, 방출 필터 및 전하 결합 소자용 CCD 카메라.

4단계 감지

형광 신호 측정을 위해 텅스텐 할로겐 램프, 여기 필터, 반사경, 렌즈, 방출 필터 및 전하 결합 소자용 CCD 카메라.

램프에서 여과된 빛은 반사경에 의해 반사되어 콘덴서 렌즈를 통과하여 각 구멍의 중앙에 집중됩니다.그러면 홀에서 방출된 형광이 거울에서 반사되어 방출 필터를 통과하여 CCD 카메라에 의해 감지됩니다.각 PCR 사이클에서 자기 여기 형광단 광은 CCD에 의해 감지될 수 있습니다.

캡처된 빛을 디지털 데이터로 변환합니다.이 방법을 실시간 PCR이라고 하며 PCR 반응의 진행 상황을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다.