전통적인 역전사 효소는 높은 온도를 견딜 수 없습니다(MMLV 활성을 위한 최적 온도는 37-50°C, AMV는 42-60°C임).더 복잡한 바이러스 RNA는 낮은 온도에서 cDNA로 효과적으로 역전사될 수 없어 검출 효율이 감소합니다.전통적인 RT-qPCR은 일반적으로 두 가지 주요 효소(역전사효소 및 DNA 중합효소)의 참여를 필요로 하므로 반응 시스템의 작동을 단순화하고 비용을 줄이는 것이 불가능합니다.여기서 우리는 두 가지 고온 내성 역전사 효소인 TtH와 RevTaq를 소개합니다.이 두 효소는 DNA 중합효소의 기능도 가지고 있어 2기능 효소라고 합니다.

TtH DNA 중합효소

호열성 박테리아인 Thermus thermophilus HB8에서 파생된 TtH에 대해 들어보셨을 것입니다.Mg2+와 같은 2가 양이온이 있는 경우 DNA 중합효소 활성을 가집니다.Taq 효소와 같이 PCR 반응에 널리 사용되지만 Taq 효소보다 내열성이 높아 GC 함량이 높은 template로 PCR에 대한 효과도 더 좋습니다.

· 이 효소는 기본적으로 3'→5' exonuclease 활성과 5'→3' exonuclease 활성이 없어 dideoxy sequencing에도 사용할 수 있다.

· 이 효소는 RTase 활성을 가지고 있습니다.Mn2+가 있으면 RTase 활성이 향상됩니다.이 기능을 이용하여 역전사 반응과 PCR 반응을 동일한 튜브에서 수행하는 즉, one-step RT-PCR이 가능합니다.그러나 Mn2+가 존재하는 경우 RT-PCR의 정확도가 높지 않습니다.RT 활동은 rnaase H 활동과 아무 관련이 없습니다.

· Tth-DNA 중합효소의 증가된 활성(pH9, 최적 +55℃～+70℃, 최대 +95℃)은 RNA 2차 구조로 인한 문제를 극복합니다.생성된 cDNA는 Mg2+ 이온의 존재 하에 동일한 효소로 PCR에 의해 증폭될 수 있습니다.

· 고온에서 역전사 및 DNA 증폭을 수행하는 Tth-DNA 중합효소의 능력으로 인해 이 효소는 정량적 RT-PCR, 클로닝 및 세포 및 바이러스 RNA의 유전자 발현 분석에 유용합니다.
· Tth-DNA 중합효소는 RT-PCR에 사용되어 최대 1kb의 RNA를 증폭합니다.

기능 및 장점

Tth DNA 중합효소:

• RT-PCR 반응에서 최소 1000 bp의 최적화된 PCR(Polymerase Chain Reaction) 제품 크기 보장

• 변형된 deoxyribonucleoside triphosphate를 기질로 수용

• RNase H 활동과 관련 없음

• 일반적으로 RNA에 존재하는 높은 2차 구조와 관련된 문제를 극복하기 위해 높은 열 안정성을 가지고 있습니다.

RevTaq RT‐PCR DNA 중합효소

역전사효소 활성을 갖는 내열성 DNA 중합효소

RevTaq-RT-PCR-DNA 중합효소는 유도 진화 및 인공 진화를 통해 얻은 역전사효소 및 DNA 중합효소 활성을 가진 조작된 고내열성 이중 기능 효소입니다.

· 95°C에서 RevTaq RT-PCR DNA 중합효소의 반감기는 40분 이상입니다.

· RevTaq RT-PCR DNA 중합효소는 RNA 템플릿에서 직접 고온 역전사를 허용하며 역전사 단계를 여러 번 반복하여 더 많은 cDNA 템플릿을 생성할 수 있습니다.

· RevTaq RT-PCR DNA 중합효소는 cyclic PCR extension 단계에서 역전사와 DNA 증폭이 동시에 일어나기 때문에 "zero-step" RT-PCR(등온 역전사 단계 없음)을 허용합니다.이것은 또한 고온에서 역전사 반응을 촉진하여 RNA의 강한 2차 구조를 고온에서 녹이는 문제를 최소화합니다.

· aptamer 기반 hot-start 공식으로 인해 RevTaq RT-PCR DNA polymerase는 annealing 및 extension 온도가 57°C보다 높을 때 더 나은 결과를 생성합니다.

· 효소는 내열성이 있으므로 융점이 매우 높은(>60°C) 프라이머와 프로브를 설계하는 것이 좋습니다.

· 반응 설정 과정에서 온도 구배를 통해 Annealing/extension 단계의 온도를 최적화하는 것이 좋습니다.

· 온도가 높을수록 PCR의 특이성이 높아집니다.DNA Primer:RNA Template hybridization은 일반적으로 DNA Primer:cDNA Template duplex보다 녹는점이 높기 때문에 역전사 사이클은 일반적으로 PCR 사이클보다 높은 온도에서 수행됩니다.

· RevTaq RT-PCR DNA 중합효소는 유전자 조작 및 최적화되었으며, 앰플리콘 크기는 60-300 bp 사이입니다.

RevTaq RT-PCR DNA 중합효소 검출 한계는 4 copies/

최적화된 반응 시스템(고융점 프라이머 설정)이 그림에 나와 있습니다.RevTaq RT-PCR DNA 중합효소 구동 RT-PCR은 TaqPath 1단계 RT-qPCR 마스터 믹스보다 더 나은 감도와 더 낮은 검출 샘플 희석 기울기를 나타냅니다.

더 많은 이점:

빠른 시작 기능 → 초기 열 변성 단계를 건너뛸 수 있습니다.

Hot-start aptamer formula → 즉시 100% 효소 활성을 제공하고 저온(<57°C)에서 비특이적 증폭을 방지합니다.

쪼개짐 기능 → RevTaq RT-PCR DNA 중합효소가 미정제 반응 샘플도 처리할 수 있기 때문에 RNA 추출 단계가 생략됩니다.핫 RT-PCR 사이클에서 진핵생물, 박테리아 및 바이러스의 세포막을 즉시 파괴할 수 있습니다.

IVD 원자재 수준 → 높은 품질 기준 및 매우 경쟁력 있는 가격