• PCR은 소량의 DNA 주형에서 DNA를 증폭하는 데 사용되는 방법입니다.RT-PCR은 역전사를 사용하여 증폭될 수 있는 RNA 소스로부터 DNA 주형을 생성합니다.
• PCR 및 RT-PCR은 일반적으로 종말점 반응인 반면, qPCR 및 RT-qPCR은 PCR 반응 중 생성물 합성 속도의 동역학을 사용하여 존재하는 주형의 양을 정량화합니다.
• 디지털 PCR과 같은 새로운 방법은 초기 DNA 주형의 절대적인 정량을 제공하는 반면, 등온 PCR과 같은 방법은 값비싼 장비의 필요성을 줄여 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다.

중합효소연쇄반응(PCR)은 DNA 및 RNA 서열을 증폭하고 검출하기 위해 비교적 간단하고 널리 사용되는 분자 생물학 기술입니다.종종 며칠이 걸릴 수 있는 전통적인 DNA 복제 및 증폭 방법과 비교하여 PCR에는 단 몇 시간만 필요합니다.PCR은 매우 민감하며 특정 서열의 검출 및 증폭을 위해 최소한의 템플릿이 필요합니다.기본적인 PCR 방법은 단순한 DNA 및 RNA 검출에서 더욱 발전했습니다.아래에서는 귀하의 연구 요구에 맞게 Enzo Life Sciences에서 제공하는 다양한 PCR 방법과 시약에 대한 개요를 제공했습니다.우리는 과학자들이 다음 연구 프로젝트에 사용할 PCR 시약에 신속하게 접근할 수 있도록 돕는 것을 목표로 합니다!

PCR

표준 PCR의 경우 DNA 중합효소, 마그네슘, 뉴클레오티드, 프라이머, 증폭할 DNA 주형 및 열순환기만 있으면 됩니다.PCR 메커니즘은 그 목적만큼 간단합니다. 1) 이중 가닥 DNA(dsDNA)가 열로 변성되고, 2) 프라이머가 단일 DNA 가닥에 정렬되고, 3) 프라이머가 DNA 중합효소에 의해 확장되어 두 개의 복사본이 생성됩니다. 원래 DNA 가닥.일련의 온도와 시간에 따른 변성, 어닐링 및 신장 과정을 증폭의 한 주기라고 합니다(그림 1).

주기의 각 단계는 사용된 템플릿과 프라이머 세트에 맞게 최적화되어야 합니다.이 주기는 약 20~40회 반복되며, 증폭된 산물은 일반적으로 아가로스 겔을 사용하여 분석할 수 있습니다(그림 2).

PCR은 매우 민감한 방법이고 단일 반응에는 매우 적은 양이 필요하므로 여러 반응에 대한 마스터 믹스를 준비하는 것이 좋습니다.마스터 믹스는 잘 혼합된 다음 반응 수에 따라 분할되어야 하며 각 반응에 동일한 양의 효소, dNTP 및 프라이머가 포함되도록 해야 합니다.Enzo Life Sciences와 같은 많은 공급업체에서는 프라이머와 DNA 템플릿을 제외한 모든 것이 이미 포함된 PCR 혼합물도 제공합니다.

구아닌/시토신이 풍부한(GC가 풍부한) 영역은 표준 PCR 기술의 어려움을 나타냅니다.GC가 풍부한 시퀀스는 GC 함량이 낮은 시퀀스보다 더 안정적입니다.또한, GC가 풍부한 서열은 헤어핀 루프와 같은 2차 구조를 형성하는 경향이 있습니다.결과적으로 GC가 풍부한 이중 가닥은 변성 단계에서 완전히 분리되기 어렵습니다.결과적으로, DNA 중합효소는 방해 없이 새로운 가닥을 합성할 수 없습니다.변성 온도가 높을수록 이를 개선할 수 있으며, 어닐링 온도를 높이고 어닐링 시간을 짧게 조정하면 GC가 풍부한 프라이머의 비특이적 결합을 방지할 수 있습니다.추가 시약은 GC가 풍부한 서열의 증폭을 향상시킬 수 있습니다.DMSO, 글리세롤 및 베타인은 GC 상호작용으로 인해 발생하는 2차 구조를 파괴하여 이중 가닥의 분리를 촉진하는 데 도움이 됩니다.

핫 스타트 PCR

비특이적 증폭은 PCR 과정에서 발생할 수 있는 문제입니다.PCR에 사용되는 대부분의 DNA 중합효소는 약 68°C~72°C의 온도에서 가장 잘 작동합니다.그러나 효소는 비록 낮은 정도이기는 하지만 더 낮은 온도에서도 활성을 나타낼 수 있습니다.어닐링 온도보다 훨씬 낮은 온도에서는 반응이 얼음 위에서 설정되더라도 프라이머가 비특이적으로 결합하여 비특이적 증폭으로 이어질 수 있습니다.이는 특정 온도에 도달한 후에만 DNA 중합효소에서 분리되는 중합효소 억제제를 사용하여 예방할 수 있습니다. 따라서 핫 스타트 PCR이라는 용어가 사용됩니다.억제제는 중합효소에 결합하여 초기 변성 온도(일반적으로 95°C)에서 변성되는 항체일 수 있습니다.

고충실도 중합효소

DNA 중합효소는 원래의 주형 서열에 맞게 상당히 정확하게 증폭되지만, 뉴클레오티드 일치에 실수가 발생할 수 있습니다.복제와 같은 응용 분야의 불일치로 인해 전사물이 잘리고 다운스트림 단백질이 잘못 번역되거나 비활성화될 수 있습니다.이러한 불일치를 방지하기 위해 "교정" 활동이 있는 폴리머라제가 식별되어 작업 흐름에 통합되었습니다.최초의 교정 중합효소인 Pfu는 1991년 Pyrococcus furiosus에서 확인되었습니다.이 Pfu 효소는 3'에서 5' 엑소뉴클레아제 활성을 가지고 있습니다.DNA가 증폭됨에 따라 엑소뉴클레아제는 가닥의 3' 말단에서 일치하지 않는 뉴클레오티드를 제거합니다.그런 다음 올바른 뉴클레오티드가 교체되고 DNA 합성이 계속됩니다.잘못된 뉴클레오티드 서열의 식별은 올바른 뉴클레오시드 삼인산염과 효소의 결합 친화도를 기반으로 하며, 여기서 비효율적인 결합은 합성 속도를 늦추고 올바른 교체를 허용합니다.Pfu 폴리머라제의 교정 활성으로 인해 Taq DNA 폴리머라제에 비해 최종 서열에서 오류가 더 적습니다.최근에는 다른 교정 효소가 확인되었으며 DNA 증폭 중 오류율을 더욱 줄이기 위해 원래 Pfu 효소의 변형이 이루어졌습니다.

RT-PCR

역전사 PCR 또는 RT-PCR을 통해 RNA를 주형으로 사용할 수 있습니다.추가적인 단계를 통해 RNA를 검출하고 증폭할 수 있습니다.역전사효소를 사용하여 RNA를 상보성 DNA(cDNA)로 역전사합니다.RNA 템플릿의 품질과 순도는 RT-PCR의 성공에 필수적입니다.RT-PCR의 첫 번째 단계는 DNA/RNA 하이브리드의 합성입니다.역전사효소는 또한 하이브리드의 RNA 부분을 분해하는 RNase H 기능을 가지고 있습니다.단일 가닥 DNA 분자는 역전사효소의 DNA 의존성 DNA 중합효소 활성에 의해 cDNA로 완성됩니다.첫 번째 가닥 반응의 효율성은 증폭 과정에 영향을 미칠 수 있습니다.이제부터는 표준 PCR 절차를 사용하여 cDNA를 증폭합니다.RT-PCR을 통해 RNA를 cDNA로 되돌릴 수 있는 가능성은 많은 장점이 있으며 주로 유전자 발현 분석에 사용됩니다.RNA는 단일 가닥이고 매우 불안정하여 작업하기가 어렵습니다.이는 일반적으로 생물학적 샘플에서 RNA 전사물을 정량화하는 qPCR의 첫 번째 단계 역할을 합니다.

qPCR 및 RT-qPCR

정량적 PCR(qPCR)은 다양한 응용 분야에서 핵산을 검출, 특성화 및 정량화하는 데 사용됩니다.RT-qPCR에서는 위에서 설명한 대로 RNA 전사물을 먼저 cDNA로 역전사하여 정량화하는 경우가 많으며 이후에 qPCR이 수행됩니다.표준 PCR에서처럼 DNA는 변성, 어닐링, 신장의 세 가지 반복 단계를 통해 증폭됩니다.그러나 qPCR에서는 형광 라벨링을 통해 PCR이 진행됨에 따라 데이터를 수집할 수 있습니다.이 기술은 사용 가능한 방법과 화학 물질의 범위로 인해 많은 이점을 가지고 있습니다.

염료 기반 qPCR(일반적으로 녹색)에서 형광 라벨링을 사용하면 dsDNA 결합 염료를 사용하여 증폭된 DNA 분자를 정량화할 수 있습니다.각 주기 동안 형광이 측정됩니다.형광 신호는 복제된 DNA의 양에 비례하여 증가합니다.따라서 DNA는 "실시간"으로 정량화됩니다(그림 3).염료 기반 qPCR의 단점은 한 번에 하나의 표적만 검사할 수 있고 염료가 샘플에 존재하는 모든 ds-DNA에 결합한다는 것입니다.

프로브 기반 qPCR에서는 각 샘플에서 많은 표적을 동시에 검출할 수 있지만 이를 위해서는 프라이머 외에 사용되는 표적 특이적 프로브의 최적화 및 설계가 필요합니다.여러 유형의 프로브 디자인을 사용할 수 있지만 가장 일반적인 유형은 형광단과 소광제를 통합하는 가수분해 프로브입니다.형광 공명 에너지 전달(FRET)은 프로브가 손상되지 않은 상태에서 소광제를 통해 형광단이 방출되는 것을 방지합니다.그러나 PCR 반응 중에 프로브는 프라이머 확장 및 결합된 특정 서열의 증폭 중에 가수분해됩니다.프로브의 절단으로 인해 형광단이 소광제에서 분리되어 증폭에 따라 형광이 증가합니다(그림 4).따라서 프로브 기반 qPCR 반응의 형광 신호는 샘플에 존재하는 프로브 표적 서열의 양에 비례합니다.프로브 기반 qPCR은 염료 기반 qPCR보다 더 특이적이므로 qPCR 기반 진단 분석에 사용되는 기술인 경우가 많습니다.

등온 증폭

위에서 언급한 PCR 기술에는 변성, 어닐링 및 확장 단계를 위해 챔버 온도를 정확하게 높이거나 낮추기 위해 고가의 열순환 장비가 필요합니다.이러한 정밀한 장치가 필요하지 않고 간단한 수조에서 또는 관심 있는 세포 내에서도 수행할 수 있는 다양한 기술이 개발되었습니다.이러한 기술을 총칭하여 등온 증폭이라고 하며 지수, 선형 또는 계단식 증폭을 기반으로 작동합니다.

등온 증폭의 가장 잘 알려진 유형은 루프 매개 등온 증폭(LAMP)입니다.LAMP는 65⁰C에서 지수 증폭을 사용하여 주형 DNA 또는 RNA를 증폭합니다.LAMP를 수행할 때 표적 DNA 영역에 상보적인 4~6개의 프라이머를 DNA 중합효소와 함께 사용하여 새로운 DNA를 합성합니다.이들 프라이머 중 2개는 다른 프라이머의 서열을 인식하고 이를 결합하는 상보적 서열을 갖고 있어 새로 합성된 DNA에 "루프" 구조가 형성되도록 하여 후속 증폭 라운드에서 프라이머 어닐링을 돕습니다.LAMP는 형광, 아가로스 겔 전기영동 또는 비색법을 포함한 여러 방법으로 시각화할 수 있습니다.비색법으로 제품 유무를 쉽게 시각화하고 감지할 수 있으며 고가의 장비가 필요하지 않기 때문에 LAMP는 임상 실험실 테스트가 용이하지 않은 지역의 SARS-CoV-2 테스트 또는 샘플 보관 및 운송에 적합한 옵션이 되었습니다. 불가능했거나 이전에 PCR 열순환 장비가 없었던 실험실에서는 불가능했습니다.