뉴스 - 완전한 PCR 프라이머 디자인 및 PCR 세부 정보

프라이머 디자인 기초 (99% 문제 해결 가능)

1. Primer 길이: 교과서는 15-30bp, 보통 20bp 정도를 요구합니다.실제 조건은 특이성을 보장하기 위해 18-24bp가 더 좋지만 길수록 좋습니다. 너무 긴 프라이머는 또한 특이성을 감소시키고 수율을 감소시킵니다.

2. Primer 증폭 범위: 200-500bp가 적당하며 특정 조건에서 fragment를 10kb까지 확장할 수 있습니다.

3. Primer base: G+C의 함량은 40~60%이어야 하며, G+C가 너무 적으면 증폭효과가 좋지 않고, G+C가 너무 많으면 불특정 밴드가 나타나기 쉽다.ATGC는 5개 이상의 퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오티드 클러스터를 피하면서 무작위로 분포하는 것이 가장 좋습니다.안정성을 높이기 위해 5' 말단 및 중간 서열에 대한 Multi-gc, 3' 말단에서 풍부한 GC, 마지막 3개 염기에 대한 GC 없음 또는 마지막 5개 염기 중 3개에 대한 GC 없음.

4. 프라이머의 2차 구조를 피하고 두 프라이머 사이의 보완, 특히 3' 말단에서의 보완을 피하십시오. 그렇지 않으면 프라이머 이량체가 형성되고 비특이적 증폭 밴드가 생성됩니다.

5. 프라이머의 3' 말단에 있는 염기, 특히 마지막 및 끝에서 두 번째 염기는 쌍을 이루지 않은 말단 염기로 인한 PCR 실패를 피하기 위해 엄격하게 쌍을 이루어야 합니다.

6. 프라이머에는 적절한 절단 부위가 있거나 첨가될 수 있으며, 증폭된 표적 서열은 바람직하게는 절단 분석 또는 분자 클로닝에 매우 유익한 적절한 절단 부위를 가져야 합니다.

7. 프라이머의 특이성: 프라이머는 핵산 서열 데이터베이스의 다른 서열과 명백한 상동성을 나타내지 않아야 합니다.

8. 소프트웨어 사용 방법 배우기: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3(이 온라인 디자인이 가장 효과적임).

위의 내용으로 프라이머 디자인 문제를 99% 이상 해결할 수 있습니다.

프라이머 디자인의 세부 사항 제어

1. 프라이머 길이

일반적인 프라이머 길이는 18~30염기입니다.일반적으로 프라이머의 어닐링 온도를 결정하는 가장 중요한 요소는 프라이머의 길이이다.프라이머의 어닐링 온도는 일반적으로 선택되며(Tm 값 -5℃), 일부는 Tm 값을 직접 사용합니다.다음 공식을 사용하여 프라이머의 어닐링 온도를 대략적으로 계산할 수 있습니다.

primer의 길이가 20bp 이하인 경우: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃

primer 길이가 20bp 이상인 경우: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/length-5℃

또한 많은 소프트웨어를 사용하여 어닐링 온도를 계산할 수 있으며 계산 원리가 다르기 때문에 때때로 계산된 값에 작은 차이가 있을 수 있습니다.PCR 반응을 최적화하기 위해 54℃ 이상의 annealing 온도를 보장하는 가장 짧은 프라이머를 사용하여 최고의 효율성과 특이성을 제공합니다.

전반적으로, 프라이머 특이성은 각각의 추가 뉴클레오티드에 대해 4배 증가하므로 대부분의 적용을 위한 최소 프라이머 길이는 18뉴클레오티드입니다.프라이머 길이의 상한은 그다지 중요하지 않으며 주로 반응 효율과 관련이 있습니다.엔트로피 때문에 프라이머가 길수록 DNA 중합효소가 결합할 수 있는 안정적인 이중 가닥 주형을 형성하기 위해 표적 DNA에 결합하기 위해 어닐링하는 속도가 낮아집니다.

소프트웨어를 사용하여 프라이머를 디자인할 때 프라이머의 길이는 차례로 TM 값에 따라 결정될 수 있으며, 특히 형광 정량 PCR의 프라이머의 경우 TM=60℃ 정도로 제어해야 합니다.

2.GC 내용

일반적으로 프라이머 염기서열에서 G+C의 함량은 40%~60%이며 GC 함량과 한 쌍의 프라이머의 Tm 값이 일치해야 합니다.프라이머가 심각한 GC 또는 AT 성향을 가지고 있다면, 적절한 양의 A, T 또는 G 및 C 테일을 프라이머의 5' 말단에 추가할 수 있습니다.

3. 어닐링 온도

어닐링 온도는 언체인 온도보다 5℃ 낮아야 합니다.프라이머 염기의 수가 적으면 어닐링 온도를 적절하게 높일 수 있어 PCR의 특이성을 높일 수 있습니다.염기 수가 많으면 적절하게 어닐링 온도를 낮출 수 있습니다.4℃ ~ 6℃의 한 쌍의 프라이머 사이의 annealing 온도 차이는 PCR 수율에 영향을 미치지 않지만 이상적인 한 쌍의 프라이머 쌍의 annealing 온도는 동일하며 55℃ ~ 75℃ 사이에서 변할 수 있습니다.

4. 증폭 템플릿의 2차 구조 영역을 피하십시오.

증폭된 단편을 선택할 때 템플릿의 2차 구조 영역을 피하는 것이 가장 좋습니다.대상 조각의 안정적인 2차 구조는 템플릿 선택에 도움이 되는 관련 컴퓨터 소프트웨어로 예측 및 추정할 수 있습니다.실험결과 팽창하고자 하는 영역의 자유에너지(△G)가 58.6lkJ/mol 이하일 때 팽창에 실패하는 경우가 많다.

5. 표적 DNA와의 불일치

증폭된 표적 DNA 서열이 크면 프라이머가 표적 DNA의 여러 부분에 결합하여 여러 밴드가 결과에 나타날 수 있습니다.이번에는 BLAST 소프트웨어 테스트 웹사이트를 사용해야 합니다.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.두 시퀀스 정렬(bl2seq)을 선택합니다.

영역 1에 프라이머 서열을 붙여넣고 영역 2에 표적 DNA 서열을 붙여넣는 것은 상호 교환이 가능하며 BLAST는 상보성, 안티센스 및 기타 가능성을 계산하므로 사용자는 두 사슬이 감지 사슬인지 여부를 알 필요가 없습니다.데이터베이스에 있는 시퀀스의 GI 번호를 알고 있는 경우 GI 번호를 입력할 수도 있으므로 시퀀스의 많은 부분을 붙여넣을 필요가 없습니다.마지막으로 3에서 정렬을 클릭하여 프라이머가 표적 DNA에 여러 상동 사이트를 가지고 있는지 확인합니다.

6. 프라이머 터미널

프라이머의 3' 말단은 확장이 시작되는 곳이므로 불일치가 시작되는 것을 방지하는 것이 중요합니다.3' 말단은 3개 이상의 연속적인 G 또는 C가 아니어야 하는데, 이는 프라이머가 G+C 농축 서열 영역에서 실수로 트리거되도록 하기 때문입니다.3' 말단은 특수 PCR(AS-PCR) 반응을 제외하고는 어떠한 2차 구조도 형성할 수 없으며, 프라이머의 3' 말단은 불일치할 수 없습니다.예를 들어, 인코딩 영역이 증폭되는 경우, 코돈의 세 번째 위치가 퇴화되기 쉬워 증폭의 특이성 및 효율에 영향을 미치기 때문에 프라이머의 3' 말단이 코돈의 세 번째 위치에서 종결되어서는 안 됩니다.annexation primer를 사용할 경우 codon use table을 참고하여 생물학적 선호도에 유의하고, 3' end에 annexation primer를 사용하지 않고 고농도(1uM-3uM)의 primer를 사용합니다.

7. 프라이머의 2차 구조

프라이머 자체는 상보적 서열을 가져서는 안 되며, 그렇지 않으면 프라이머 자체가 헤어핀 구조로 접힐 것이고 이 2차 구조는 입체 장애로 인해 프라이머와 템플릿의 결합에 영향을 미칠 것입니다.인위적인 판단을 할 경우 프라이머 자체의 연속적인 상보 염기는 3bp를 넘지 않아야 합니다.두 프라이머 사이에 상보성이 없어야 하며, 특히 3' 말단의 상보적 중첩은 프라이머 다이머의 형성을 방지하기 위해 피해야 합니다.일반적으로 한 쌍의 프라이머 사이에 4개 이하의 연속 염기 상동성 또는 상보성이 있어야 합니다.

8. 마커 또는 유전자좌 추가

5' 말단은 증폭 특이성에 거의 영향을 미치지 않으므로 증폭 특이성에 영향을 주지 않고 변형될 수 있습니다.프라이머 5' 말단의 변형은 다음을 포함하였다: 효소 제한 부위 추가;표지된 비오틴, 형광, 디곡신, Eu3+ 등. 단백질 결합 DNA 서열 도입;돌연변이 부위 도입, 돌연변이 서열 삽입 및 누락, 프로모터 서열 도입 등. 여분의 염기는 증폭 효율에 다소 영향을 미치고 프라이머 이합체 형성 가능성을 높이지만 다음 단계를 위해 일부 양보해야 합니다.제한 부위 및 프로모터 서열과 같이 표적 서열에 존재하지 않는 추가 서열은 특이성에 영향을 미치지 않으면서 프라이머의 5' 말단에 부가될 수 있다.이러한 서열은 프라이머 Tm 값 계산에 포함되지 않지만 상보성 및 내부 2차 구조에 대해 테스트해야 합니다.

9. 서브클론

대부분의 경우 PCR은 예비 클로닝일 뿐이며, 타겟 단편을 다양한 벡터에 서브클로닝해야 하므로 PCR 단계에서 다음 작업을 위한 추가 염기를 설계해야 합니다.

서브클로닝을 위해 설계된 일부 시퀀스는 아래에 요약되어 있습니다.
제한 엔도뉴클레아제 제한 사이트 추가

효소 제한 부위를 추가하는 것은 PCR 산물을 서브클로닝하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다.일반적으로 절단 부위는 6개의 염기이며, 절단 부위의 5' 말단 이외에 2~3개의 보호 염기를 추가할 필요가 있다.그러나 다른 효소에 필요한 보호 염기의 수는 다릅니다.예를 들어, SalⅠ은 보호 염기가 필요하지 않으며, EcoRⅤ는 보호 염기가 1개, NotⅠ은 보호 염기가 2개, Hind Ⅲ는 보호 염기가 3개 필요합니다.

LIC는 꼬리를 추가합니다

LIC의 전체 이름은 Ligation-Independent cloning으로, 특히 pET 벡터의 일부를 위해 Navogen이 발명한 클로닝 방법입니다.LIC 방법에 의해 제조된 pET 캐리어는 표적 삽입 단편에 상응하는 끈적끈적한 말단을 보완하는 비-상보적인 12-15 염기 단일 가닥 끈적끈적한 말단을 갖는다.증폭 목적을 위해 삽입된 단편의 프라이머 5' 서열은 LIC 벡터를 보완해야 합니다.T4 DNA 중합효소의 3'→5' extranect 활성은 짧은 시간 후에 삽입된 단편에 단일 가닥 끈끈한 말단을 형성할 수 있습니다.준비된 insert fragment와 vector의 상호 annealing을 통해서만 product가 형성될 수 있기 때문에 이 방법은 매우 빠르고 효율적이며 direct cloning이다.
지시된 TA 클론 추가 꼬리
TA 클로닝은 단편을 벡터로 표적화할 수 없었기 때문에 나중에 Invitrogen은 클로닝을 표적화할 수 있는 벡터를 도입했습니다. 이 벡터에는 한쪽 끝에 4개의 눈에 띄는 염기 GTGGS가 포함되어 있습니다.따라서, PCR 프라이머의 디자인에서 단편이 "배향"될 수 있도록 그에 따라 상보적인 서열이 추가되어야 합니다.

시간이 부족하다면 유전자를 벡터와 결합하는 직접 합성을 시도할 수 있습니다. 이것은 우리가 근육학자에서 ET 유전자 합성이라고 부르는 것입니다.

D. In-Fusion 클로닝 방법

리가아제가 필요하지 않으며 긴 반응이 필요하지 않습니다.선형화된 벡터의 양 말단에 서열이 도입되는 한 프라이머 디자인에서 PCR 산물과 선형화된 벡터를 BSA가 포함된 in-fusion 효소 용액에 첨가하고 상온에서 30분 동안 두어 형질전환을 수행할 수 있다.이 방법은 특히 대용량 변환에 적합합니다.

10. 머지 프라이머

때로는 프라이머 디자인에 대해 제한된 서열 정보만 알려져 있습니다.예를 들어, 아미노산 서열만 알고 있다면 병합 프라이머를 설계할 수 있습니다.합병 프라이머는 단일 아미노산을 암호화하는 모든 다른 염기 가능성을 나타내는 다른 서열의 혼합물입니다.특이성을 높이려면 코돈 사용 표를 참조하여 다른 유기체의 염기 사용 선호도에 따라 결합을 줄일 수 있습니다.하이포잔틴은 프라이머의 어닐링 온도를 낮추기 위해 모든 염기와 쌍을 이룰 수 있습니다.3' 말단에서 마지막 3개 염기의 어닐링이 잘못된 부위에서 PCR을 개시하기에 충분하기 때문에 프라이머의 3' 말단에 부가된 염기를 사용하지 마십시오.더 높은 프라이머 농도(1μM ~ 3μM)는 많은 부가 혼합물의 프라이머가 표적 템플릿에 특이적이지 않기 때문에 사용됩니다.

PCR 원료제어

1. 프라이머 수량

각 프라이머의 농도는 0.1~1umol 또는 10~100pmol입니다.가장 적은 양의 프라이머로 원하는 결과를 얻는 것이 좋습니다.프라이머의 농도가 높으면 불일치 및 비특이적 증폭이 발생하고 프라이머 사이에 다이머가 형성될 가능성이 높아집니다.

2. 프라이머 농도

프라이머의 농도는 특이성에 영향을 미칩니다.최적의 프라이머 농도는 일반적으로 0.1~0.5μM입니다.더 높은 프라이머 농도는 비특이적 산물의 증폭으로 이어집니다.

3. 프라이머 소둔온도

프라이머에 대한 또 다른 중요한 매개변수는 용융 온도(Tm)입니다.이는 프라이머 및 상보적 서열의 50%가 이중 가닥 DNA 분자로 나타날 때의 온도입니다.Tm은 PCR 어닐링 온도를 설정하는 데 필요합니다.이상적으로, 어닐링 온도는 표적 서열과 함께 프라이머의 효과적인 어닐링을 보장하기에 충분히 낮지만 비특이적 결합을 감소시키기에는 충분히 높습니다.55℃에서 70℃까지 적당한 어닐링 온도.어닐링 온도는 일반적으로 프라이머의 Tm보다 5℃ 낮게 설정합니다.

Tm을 설정하기 위한 몇 가지 공식이 있으며, 사용된 공식과 프라이머의 순서에 따라 크게 다릅니다.대부분의 공식은 예상 Tm 값을 제공하기 때문에 모든 어닐링 온도는 시작점일 뿐입니다.어닐링 온도를 점진적으로 높이는 여러 반응을 분석하여 특이성을 향상시킬 수 있습니다.예상 Tm-5℃ 이하에서 시작하여 Annealing 온도를 2℃씩 서서히 높입니다.더 높은 어닐링 온도는 프라이머 다이머 및 비특이적 생성물의 형성을 감소시킵니다.최상의 결과를 얻으려면 두 개의 프라이머에 대략적인 Tm 값이 있어야 합니다.프라이머 쌍의 Tm 차이가 5℃ 이상인 경우 사이클에서 더 낮은 어닐링 온도를 사용하여 프라이머가 상당한 잘못된 시작을 보일 것입니다.두 프라이머의 Tm이 다른 경우 어닐링 온도를 가장 낮은 Tm보다 5℃ 낮게 설정합니다.또는 특이성을 높이기 위해 먼저 높은 Tm을 위해 설계된 어닐링 온도에서 5개의 사이클을 수행한 다음 더 낮은 Tm을 위해 설계된 어닐링 온도에서 나머지 사이클을 수행할 수 있습니다.이렇게 하면 엄격한 조건에서 대상 템플릿의 부분 복사본을 얻을 수 있습니다.

4. 프라이머 순도 및 안정성

맞춤형 프라이머의 표준 순도는 대부분의 PCR 응용 분야에 적합합니다.탈염에 의한 벤조일 및 이소부틸릴 그룹의 제거는 최소화되므로 PCR을 방해하지 않습니다.일부 응용 프로그램은 합성 프로세스에서 전체 길이가 아닌 시퀀스를 제거하기 위해 정제가 필요합니다.이러한 절단된 서열은 DNA 합성 화학의 효율성이 100%가 아니기 때문에 발생합니다.이것은 3'에서 5'로 DNA를 만들기 위해 각 염기가 추가되면서 반복되는 화학 반응을 사용하는 순환 과정입니다.두 사이클 중 어느 쪽이든 실패할 수 있습니다.더 긴 프라이머, 특히 50개 이상의 염기는 절단된 서열의 비율이 크며 정제가 필요할 수 있습니다.

프라이머의 수율은 합성 화학 및 정제 방법의 효율성에 영향을 받습니다.Cytology 및 Shengong과 같은 바이오 제약 회사는 모두 최소 OD 단위를 사용하여 올리고뉴클레오사이드의 총 생산량을 보장합니다.맞춤형 프라이머는 건조 분말 형태로 배송됩니다.최종 농도가 100μM이 되도록 TE에서 프라이머를 재용해하는 것이 가장 좋습니다.TE는 물의 pH가 종종 산성이고 올리고뉴클레오사이드의 가수분해를 유발하기 때문에 탈이온수보다 낫습니다.

프라이머의 안정성은 보관 조건에 따라 다릅니다.건조 분말 및 용해된 프라이머는 -20℃에서 보관해야 합니다.10μM 이상의 농도로 TE에 용해된 프라이머는 -20℃에서 6개월 동안 안정적으로 보관할 수 있지만 실온(15℃~30℃)에서는 1주일 미만으로만 보관할 수 있습니다.건조 분말 프라이머는 최소 1년 동안 -20C에서, 최대 2개월 동안 실온(15C~30C)에서 보관할 수 있습니다.

5. 효소와 그 농도

현재 사용되는 Taq DNA 중합효소는 기본적으로 대장균군 박테리아에 의해 합성되는 유전자 공학 효소입니다.일반적인 PCR 반응을 촉매하는 데 필요한 효소의 양은 약 2.5U(총 반응량 100ul를 의미)입니다.농도가 너무 높으면 비특이적 증폭이 발생할 수 있습니다.농도가 너무 낮으면 합성물의 양이 줄어듭니다.

6. dNTP의 품질 및 농도

dNTP의 품질은 PCR 증폭의 농도 및 효율과 밀접한 관련이 있습니다.dNTP 분말은 과립형이며 부적절하게 보관하면 가변성이 생물학적 활성을 잃습니다.dNTP 용액은 산성이므로 1M NaOH 또는 1M Tris.HCL 완충용액을 사용하여 PH를 7.0 ~ 7.5로 조절하여 고농도로 사용해야 하며 소량씩 소포장하여 -20℃에서 냉동보관하여야 합니다.다중 동결 해동은 dNTP를 저하시킵니다.PCR 반응에서 dNTP는 50 ~ 200umol/L가 되어야 합니다.특히, 4개의 DNTPS의 농도가 같아야 한다는 점에 주의를 기울여야 한다(equal mole prep).이들 중 하나의 농도가 다른 농도와 다른 경우(높거나 낮음) 불일치가 발생합니다.농도가 너무 낮으면 PCR 제품의 수율이 감소합니다.dNTP는 Mg2+와 결합하여 유리 Mg2+의 농도를 감소시킬 수 있습니다.

7. 주형(표적 유전자) 핵산

주형 핵산의 양과 정제 정도는 PCR의 성공과 실패를 가르는 핵심 고리 중 하나입니다.전통적인 DNA 정제 방법은 일반적으로 SDS와 프로테아제 K를 사용하여 표본을 분해하고 폐기합니다.SDS의 주요 기능은 다음과 같습니다. 세포막의 지질과 단백질을 용해하여 막 단백질을 용해하여 세포막을 파괴하고 세포에서 핵 단백질을 분리합니다. SDS는 단백질과 결합하여 침전시킬 수도 있습니다.프로테아제 K는 단백질, 특히 DNA와 결합된 히스톤을 가수분해하고 소화할 수 있으며, 유기 용매 페놀과 클로로포름을 사용하여 단백질 및 기타 세포 성분을 추출하고 에탄올 또는 이소프로필 알코올을 사용하여 핵산을 침전시킬 수 있습니다.추출된 핵산은 PCR 반응의 주형으로 사용할 수 있습니다.일반적인 임상검출 검체의 경우 신속하고 간단한 방법으로 세포를 용해하고, 병원체를 용해하고, 염색체에서 단백질을 소화 및 제거하여 표적 유전자를 유리시켜 PCR 증폭에 직접 사용할 수 있습니다.RNA 템플릿 추출은 일반적으로 구아니딘 이소티오시아네이트 또는 프로테아제 K 방법을 사용하여 RNase가 RNA를 분해하는 것을 방지합니다.

8.Mg2+ 농도

Mg2+는 PCR 증폭의 특이성과 수율에 상당한 영향을 미칩니다.일반적인 PCR 반응에서 각종 dNTP의 농도가 200umol/L일 때 적절한 Mg2+ 농도는 1.5~2.0mmol/L이다.Mg2+ 농도가 너무 높으면 반응 특이성이 감소하고 비특이적 증폭이 발생하며 농도가 너무 낮으면 Taq DNA polymerase의 활성이 감소하여 반응 생성물이 감소합니다.

마그네슘 이온은 수율에 영향을 미치는 DNA 중합효소 활성과 같은 PCR의 여러 측면에 영향을 미칩니다.또 다른 예는 특이성에 영향을 미치는 프라이머 어닐링입니다.dNTP와 템플릿은 마그네슘 이온에 결합하여 효소 활성에 필요한 유리 마그네슘 이온의 양을 줄입니다.최적의 마그네슘 이온 농도는 다른 프라이머 쌍과 템플릿에 따라 다르지만 200μM dNTP를 사용한 일반적인 PCR 시작 농도는 1.5mM입니다(참고: 실시간 정량 PCR의 경우 형광 프로브가 있는 3~5mM 마그네슘 이온 용액 사용).유리 마그네슘 이온의 농도가 높을수록 수율이 증가하지만 비특이적 증폭이 증가하고 충실도가 감소합니다.최적 농도를 결정하기 위해 마그네슘 이온 적정을 1mM에서 3mM까지 0.5mM 단위로 수행했습니다.마그네슘 이온 최적화에 대한 의존성을 줄이기 위해 Platinum Taq DNA polymerase를 사용할 수 있습니다.Platinum Taq DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소보다 더 넓은 범위의 마그네슘 이온 농도에서 기능을 유지할 수 있으므로 최적화가 덜 필요합니다.

9. PCR 촉진 첨가제

어닐링 온도, 프라이머 설계 및 마그네슘 이온 농도의 최적화는 대부분의 템플릿의 고도로 특이적인 증폭에 충분합니다.그러나 GC 함량이 높은 템플릿을 포함한 일부 템플릿에는 추가 조치가 필요합니다.DNA의 녹는 온도에 영향을 미치는 첨가제는 제품 특이성과 수율을 향상시키는 또 다른 방법을 제공합니다.최상의 결과를 얻으려면 템플릿을 완전히 변성해야 합니다.

또한 2차 구조는 프라이머 결합 및 효소 확장을 방지합니다.

포름아미드, DMSO, 글리세린, 베타인 및 PCRx Enhancer Solution을 포함한 PCR 첨가제는 증폭을 향상시킵니다.그들의 가능한 메커니즘은 용융 온도를 낮추어 프라이머의 어닐링을 돕고 2차 구조 영역을 통한 DNA 폴리머라제 확장을 돕는 것입니다.PCRx 솔루션에는 다른 장점이 있습니다.Platinum Taq DNA 중합효소 및 Platinum Pfx DNA 중합효소와 함께 사용하는 경우 최소한의 마그네슘 이온 최적화가 필요합니다.따라서 Platinum 기술은 세 번째 접근법인 마그네슘 이온 최적화의 의존성을 줄이면서 특이성을 높이기 위해 첨가제와 결합됩니다.최상의 결과를 얻으려면 첨가제, 특히 Taq DNA 중합효소를 억제하는 DMSO, 포름아미드 및 글리세롤의 농도를 최적화해야 합니다.

Foreasy Taq DNA 중합효소

10. 핫 스타트

핫 스타트 PCR은 우수한 프라이머 설계와 함께 PCR 특이성을 향상시키는 가장 중요한 방법 중 하나입니다.Taq DNA 중합효소의 최적 신장 온도는 72℃이지만 중합효소는 상온에서 활성을 유지합니다.따라서 PCR 반응을 준비하는 동안과 열 사이클 초기에 유지 온도가 어닐링 온도보다 낮을 때 비특이적 생성물이 생성됩니다.일단 형성되면 이러한 비특이적 제품은 효과적으로 증폭됩니다.Hot-start PCR은 프라이머 디자인에 사용되는 사이트가 사이트 지정 돌연변이, 발현 복제 또는 DNA 공학에 사용되는 유전 요소의 구성 및 조작과 같은 유전 요소의 위치에 의해 제한될 때 특히 효과적입니다.

Taq DNA polymerase의 활성을 제한하는 일반적인 방법은 PCR 반응 용액을 얼음 위에 준비하고 예열된 PCR 장치에 넣는 것입니다.이 방법은 간단하고 저렴하지만 효소의 활성을 완전하게 하지 못하므로 비특이적 산물의 증폭을 완전히 제거하지는 못합니다.

열 프라이밍은 PCR 장치가 변성 온도에 도달할 때까지 필수 구성 요소를 억제하여 DNA 합성을 지연시킵니다.지연된 Taq DNA 중합효소 추가를 포함한 대부분의 수동 열 개시 방법은 특히 처리량이 많은 응용 분야에서 번거롭습니다.다른 열 프라이밍 방법은 왁스 쉴드를 사용하여 마그네슘 이온 또는 효소를 포함한 필수 구성 요소를 둘러싸거나 템플릿 및 버퍼와 같은 반응성 구성 요소를 물리적으로 분리합니다.열 주기 동안 왁스가 녹으면서 다양한 구성 요소가 방출되고 함께 혼합됩니다.수동 핫 스타트 방법과 마찬가지로 왁스 실드 방법은 번거롭고 오염되기 쉬우며 높은 처리량 응용 분야에는 적합하지 않습니다.

Platinum DNA polymerase는 auto hot start PCR에 편리하고 효율적입니다.Platinum Taq DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소에 대한 단클론 항체와 결합된 재조합 Taq DNA 중합효소로 구성됩니다.항체는 장시간 온도 유지 동안 효소 활성을 억제하기 위해 PCR에 의해 제형화됩니다.변성 단계의 94℃ 절연 동안 Taq DNA 중합효소가 반응으로 방출되어 완전한 중합효소 활성을 회복했습니다.열 개시를 위해 화학적으로 변형된 Taq DNA 폴리머라제와 달리 백금 효소는 폴리머라제를 활성화하기 위해 94℃(10~15분)에서 장기간 절연이 필요하지 않습니다.PlatinumTaq DNA polymerase를 사용하면 94℃에서 2분 후에 Taq DNA polymerase 활성의 90%가 회복되었습니다.

Foreasy HS Taq DNA 중합효소

11. 네스트-PCR

중첩된 프라이머를 사용한 연속적인 증폭 라운드는 특이성과 민감도를 향상시킬 수 있습니다.첫 번째 라운드는 15~20주기의 표준 증폭입니다.초기 증폭 생성물의 작은 분획을 100 내지 1000배 희석하고 15 내지 20주기 동안 2차 증폭에 첨가하였다.대안적으로, 초기 증폭 산물은 겔 정제에 의해 크기가 조정될 수 있습니다.2차 증폭에는 중첩된 프라이머가 사용되며, 이는 첫 번째 프라이머 내부의 표적 서열에 결합할 수 있습니다.중첩된 PCR을 사용하면 두 프라이머 세트에 상보적인 표적 서열이 거의 없기 때문에 여러 표적 부위의 증폭 가능성이 줄어듭니다.동일한 프라이머로 동일한 총 사이클 수(30~40)로 비특이적 부위를 증폭했습니다.Nested PCR은 제한된 표적 서열(예: 희귀 mRNA)의 감도를 높이고 어려운 PCRS(예: 5' RACE)의 특이성을 향상시킵니다.

12. 내림차순 PCR

Descending PCR은 PCR의 처음 몇 사이클 동안 엄격한 어닐링 조건을 사용하여 특이성을 향상시킵니다.이 사이클은 예상 Tm보다 약 5℃ 높은 어닐링 온도에서 시작하여 어닐링 온도가 Tm 5℃ 미만이 될 때까지 각 사이클은 1℃씩 2℃씩 감소합니다.상동성이 가장 높은 대상 템플릿만 증폭됩니다.이러한 제품은 후속 주기에서 계속 확장되어 증폭된 비특이적 제품을 밀어냅니다.Descending PCR은 AFLP DNA 지문 채취와 같이 프라이머와 표적 주형 간의 상동 정도를 알 수 없는 방법에 유용합니다.

관련 PCR 키트

PCR Easyᵀᴹ (염료 포함)

2× PCR 영웅^TMMix 시스템은 일반 PCR Mix 시스템보다 PCR inhibitor에 대한 내성이 높으며, 다양한 complex template의 PCR 증폭에 용이하게 대처할 수 있습니다.고유한 반응 시스템과 고효율 Taq Hero는 PCR 반응의 증폭 효율, 특이성 및 감도를 높입니다.

PCR Heroᵀᴹ (염료 포함)