정량적 PCR 또는 qPCR로도 알려진 실시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 실시간 모니터링 및 분석을 위한 방법입니다.
정량적 PCR은 조작이 간단하고 빠르고 편리하며 감도가 높고 반복성이 우수하며 오염률이 낮다는 장점이 있기 때문에 의료 검사, 약효 평가, 유전자 발현 연구, 형질전환 연구, 유전자 검출, 병원체 검출, 동식물 검출 등에 널리 사용되고 있다., 식품 테스트 및 기타 분야.
따라서 생명 과학 분야의 기초 연구에 종사하든 제약 회사, 축산 회사, 식품 회사의 직원 또는 출입국 검사 및 검역국, 환경 모니터링 부서, 병원 및 기타 부서의 직원이든 관계없이 어느 정도 노출되거나 정량적 PCR을 마스터하는 지식을 알아야 합니다.

실시간 PCR의 원리

Real Time PCR은 PCR 반응 시스템에 형광 물질을 첨가하고 PCR 반응 과정에서 형광 신호 강도를 정량적 PCR 장비로 실시간 모니터링한 후 최종적으로 실험 데이터를 분석 및 가공하는 방식이다.

【증폭 곡선]PCR의 동적 프로세스를 설명하는 곡선입니다.PCR의 증폭 곡선은 실제로 표준 지수 곡선이 아니라 시그모이드 곡선입니다.

[증폭 곡선의 플랫폼 단계]PCR 횟수의 증가, DNA polymerase의 불활성화, dNTP와 프라이머의 고갈, 반응 부산물인 pyrophosphate 등에 의한 합성 반응의 억제 등으로 PCR이 항상 기하급수적으로 확장되는 것은 아닙니다., 그리고 결국 고원에 들어갈 것입니다.

[증폭 곡선의 지수 성장 영역]플래토 단계는 크게 다르지만 증폭 곡선의 지수 성장 영역의 특정 영역에서 반복성이 매우 우수하여 PCR의 정량 분석에 매우 중요합니다.

[임계값 및 Ct값]증폭 곡선의 지수 성장 영역의 적절한 위치, 즉 임계값(Threshold)에서 형광 검출의 한계값을 설정합니다.임계값과 증폭 곡선의 교차점은 Ct 값입니다. 즉, Ct 값은 임계값에 도달했을 때의 주기(Threshold Cycle) 수를 나타냅니다.

아래 그래프는 역치선과 증폭 곡선, 역치와 Ct 값의 관계를 명확하게 보여줍니다.

【수량화하는 방법?]

Ct 값은 초기 템플릿 수의 로그와 역선형 관계에 있음이 수학적 이론에 의해 증명되었습니다.Real Time PCR은 PCR 증폭 산물을 실시간으로 모니터링하고 지수 증폭 단계에서 정량화합니다.

PCR의 각 주기마다 DNA는 2배씩 기하급수적으로 증가했고 곧 안정기에 도달했습니다.

시작 DNA의 양이 A라고 가정₀ , n주기 후 DNA 생성물의 이론적인 양은 다음과 같이 표현될 수 있습니다.

A _n =A ₀ ×2ⁿ

그러면 초기 DNA양 A 0 이 많을수록 증폭된 산물의 양이 검출값 An 에 빨리 도달하고 An 에 도달했을 때의 사이클 수가 Ct 값이 된다.즉, 초기 DNA 양 A 0 이 많을수록 증폭 곡선이 더 빨리 정점에 도달하고 이에 따라 필요한 사이클 수 n이 더 작아집니다.

농도를 알고 있는 standard의 gradient dilution을 수행하여 Real Time PCR의 template로 사용하고, 시작 DNA 양이 많은 것부터 적은 것 순으로 등간격으로 일련의 증폭 곡선을 얻습니다.Ct 값과 시작 템플릿 수의 로그 간의 선형 관계에 따라 a[표준 곡선]을 만들 수 있습니다.

농도를 알 수 없는 시료의 Ct 값을 standard curve에 대입하면 농도를 알 수 없는 시료의 초기 template 양을 얻을 수 있는데, 이것이 Real Time PCR의 정량 원리입니다.

Real Time PCR의 검출 방법

Real Time PCR은 반응 시스템에서 형광 강도를 감지하여 PCR 증폭 산물을 감지합니다.

형광염료 포매법의 원리]

형광 염료TB Green ® 과 같은 는 PCR 시스템에서 이중 가닥 DNA에 비특이적으로 결합하고 결합 시 형광을 발할 수 있습니다.

반응 시스템의 형광 강도는 PCR 주기가 증가함에 따라 기하급수적으로 증가했습니다.형광 강도를 감지하여 반응 시스템에서 DNA 증폭량을 실시간으로 모니터링할 수 있으며, 그 후 샘플에서 출발 주형의 양을 역으로 추정할 수 있습니다.

【형광 탐침법의 원리]

형광 프로브5'말단에 형광기를 가지고 있고 3'말단에 소광기를 갖고 있는 핵산서열로 주형에 특이적으로 결합할 수 있다.프로브가 손상되지 않은 경우 형광단에서 방출된 형광은 소광기에 의해 소광되어 형광을 발할 수 없습니다.프로브가 분해되면 형광 물질이 해리되어 형광을 방출합니다.

형광 프로브는 PCR 반응 용액에 추가됩니다.어닐링 과정에서 형광 프로브는 템플릿의 특정 위치에 결합합니다.신장 과정에서 PCR 효소의 5'→3' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성에 의해 주형과 혼성화된 형광 프로브를 분해할 수 있으며, 형광 물질이 해리되어 형광을 발산하게 된다.반응 시스템에서 프로브의 형광 강도를 검출함으로써 PCR 산물의 증폭량을 모니터링하는 목적을 달성할 수 있습니다.

【형광 검출 방법의 선택]

상동성이 높은 서열을 구별하고 SNP 타이핑 분석과 같은 다중 PCR 검출을 수행하는 데 사용된다면 형광 프로브 방법은 대체할 수 없습니다.
다른 Real Time PCR 실험의 경우 간단하고 쉽고 저렴한 형광 키메라 방법을 사용할 수 있습니다.

probes강한 특이성, 다중 PCR 가능

결점

증폭을 위한 높은 특이성 요구 사항;

다중 PCR 수행 불가특정 프로브 설계 필요, 고비용;

때로는 프로브 설계가 어렵습니다.

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