RT-qPCR은 분자생물학의 기본 실험이며 누구나 익숙해야 합니다.주로 RNA 추출, cDNA로의 역전사 및 실시간 형광 정량 PCR의 세 단계를 포함합니다.도움이 안 돼, 무슨 일이야?에 문제가 있을 가능성이 높음역전사 실험!역전사 실험은 RNA, dNTP, 프라이머,역전사 효소원심분리기 튜브에 넣고 잘 섞어주지만 실제 작동 과정에서는 주의해야 할 세부 사항이 여전히 많습니다.그것에 대해 배우자!

RNA의 품질을 판단하는 방법은 무엇입니까?
cDNA를 얻으려면 RNA의 품질이 중요합니다!RNA 품질은 주로 두 가지 측면에서 감지할 수 있습니다.
(1) RNA 무결성:RNA 무결성은 아가로스 겔 전기영동으로 확인할 수 있습니다.. 진핵생물을 예로 들면 완전한 전체 RNA는 3개의 명확한 밴드를 가지고 있으며 큰 것에서 작은 것까지 분자량은 28S, 18S 및 5S이며 28S는 18S보다 두 배 밝습니다.세 개의 밴드가 보이지만 밴드 유형이 흐릿하거나 Diffusion은 RNA가 부분적으로 분해되었음을 의미합니다.이때 즉시 역전사 반응을 수행하고 템플릿 입력을 적절하게 증가시키십시오.분자량이 작은 밴드만 보이거나 밴드가 보이지 않으면 RNA가 완전히 분해된 것이므로 다시 추출해야 합니다.Agilent 2100은 RNA의 무결성을 피크 다이어그램과 RIN 값으로 나타냅니다.핵산이 손상되지 않은 경우 전기영동도의 기준선은 평평합니다.핵산이 심하게 분해되면 기준선이 고르지 않고 더 많은 분해 피크가 나타납니다.RIN의 값은 RNA의 무결성을 반영하며 0-10 범위 내에서 값이 클수록 RNA의 품질이 좋습니다.음, 완성도가 높을수록.
(2) RNA의 순도:OD260/280의 비율은 UV 분광광도법으로 감지할 수 있습니다.OD260/280의 비율이 1.9~2.1이면 순도가 매우 좋습니다.
잔류 게놈 DNA로 인해 부정확한 정량 결과가 나올 수 있음
RNA를 추출할 때 우리가 얻은 RNA는 정리되지 않은 게놈 DNA(gDNA)와 섞일 수 있습니다.따라서 역전사 후의 cDNA도gDNA.다운스트림 중에정량 PCR반응,cDNA및 gDNA가 동시에 증폭되어 상대적으로 작은 CT 값이 나올 수 있으므로 결과가 편향될 수 있습니다.
그렇다면 이 상황에서 우리는 어떻게 해야 할까요?포진제안:
(1) RNA 추출 시 컬럼 추출에 의해 제거될 수 있는 역 RNA에 대해 게놈 세척을 수행한다;
(2) 추출된 RNA를 DNase로 처리I , 그러나 EDTA로 종료하십시오.
역전사 시약게놈 클리어링 모듈 포함 ;

역전사를 위한 프라이머를 선택하는 방법은 무엇입니까?
역전사 프라이머는 또한 역전사 반응의 결과에 영향을 미칩니다.실험의 특정 상황에 따라 무작위 프라이머, Oligo dT 또는 역전사를 위한 유전자 특이적 프라이머를 선택할 수 있습니다.
(1) 특정 성적증명서: 유전자 특이적 프라이머가 권장됨;
(2) 긴 단편 전사체: Oligo dT/gene-specific primer를 권장합니다.
(3) 장분절 전사체의 내부 단편: 유전자 특이적 프라이머/ 랜덤 프라이머/랜덤 프라이머 + Oligo dT.후속 qPCR 실험을 수행할 경우 Oligo dT 단독으로 사용할 경우 3′ end bias 가 발생하여 부정확한 qPCR 실험 결과가 나올 수 있으므로 Oligo dT 단독으로는 사용할 수 없습니다.
(4) miRNA: 스템루프 프라이머 또는 테일링 프라이머를 사용할 수 있습니다.

정량화를 위해 역전사 산물 cDNA를 몇 번 희석해야 합니까?
역전사 산물의 cDNA를 얻은 후 qPCR 실험을 위해 cDNA를 몇 번 희석해야 하는지가 매우 중요합니다.cDNA 농도가 너무 높거나 낮으면 증폭 효율에 영향을 줄 수 있습니다.cDNA 농도를 측정할 수 있으며 어떻게 해야 합니까?
(1) 역전사 산물의 cDNA 농도는 cDNA 산물 외에도 역전사 잔류물 Buffer, 역전사 효소, 프라이머 등이 ​​포함되어 있어 농도 측정 결과를 방해하여 OD260/280, OD260/230 ratio 비정상을 유발하여 진정한 cDNA 수율을 반영하지 못하기 때문에 측정할 수 없습니다.이때 어떤 친구들은 말할 것입니다. 그러면 정화 후 농도를 측정하겠습니다.여기서 Foregene은 역전으로 얻은 cDNA의 길이가 다르고 짧은 cDNA가 정제 과정에서 손실되기 때문에 cDNA를 정제하지 않는 것이 좋습니다.
(2) 그럼 어떻게 해야 할까요?qPCR 실험 전, cDNA의 dilution gradient는 pre-experiment를 통해 결정할 수 있습니다.예: cDNA 원액, 10배 희석 및 100배 희석을 qPCR 실험용 템플릿으로 사용하고 CT 값이 18-28 범위인 희석 계수를 선택합니다.

miRNA는 어떻게 역전사되어야 합니까?
miRNA는 단백질을 암호화하지 않는 약 22nt 크기의 단일 가닥 소분자 RNA입니다.길이가 짧아 기존의 qPCR 방법으로는 직접 정량화하기 어려우므로 miRNA를 확장해야 하는 경우가 많습니다.miRNA에 일반적으로 사용되는 역전사 방법에는 stem-loop 방법과 tailing 방법이 있습니다.
스템-루프 방법은 스템-루프 프라이머를 추가하여 miRNA를 확장하는 것입니다.이 검출 방법은 민감도와 특이도가 높지만 검출 처리량이 낮습니다.하나의 역전사는 하나의 miRNA와 내부 참조만 감지할 수 있습니다.꼬리 추가 방법은 두 가지로 구성됩니다. PolyA 중합 효소와 역전사 효소라는 두 효소의 공동 작용에 의해 완성됩니다.PolyA 중합효소는 miRNA에 PolyA 꼬리를 추가하여 길이를 늘리는 역할을 하며, 역전사효소는 역전사 반응을 수행합니다.이 방법은 높은 검출 처리량을 가지고 있으며 하나의 역전사에서 여러 miRNA 및 내부 참조를 검출할 수 있지만 stem-loop 방법에서는 민감도와 특이성이 낮습니다.