RT-qPCR 실험에는 RNA 추출 및 품질 평가, 역전사 및 qPCR의 세 단계가 포함되며, 각 단계에는 많은 주의 사항이 있으며, 아래에서 자세히 소개합니다.

Ⅰ.RNA 품질 평가

RT-qPCR 실험에서는 RNA 추출이 완료된 후 RNA의 품질을 평가해야 하며, 적격성 검증을 거쳐야 후속 실험을 진행할 수 있습니다.평가 방법으로는 분광광도계, Agilent 겔 전기영동, Agilent 2100 분석이 있으며, 그 중 가장 많이 사용되는 분광광도계와 아가로스 겔 전기영동 검출법이 있다.RNA의 품질을 보장하기 위해 RNA 농도, 순도 및 무결성의 검출 및 분석을 완료하기 위해 이 두 가지 방법을 함께 사용해야 한다는 점에 유의해야 합니다.

관련 RNA 분리 키트: 

세포 총 RNA 분리 키트

다양한 배양세포로부터 11분만에 고순도 및 고품질의 total RNA를 얻을 수 있습니다.

동물 총 RNA 분리 키트

다양한 동물 조직으로부터 고순도, 고품질의 total RNA를 빠르고 효율적으로 추출합니다.

분광광도계:

분광 광도계는 주로 RNA의 농도와 순도를 결정하는 데 사용되지만 RNA 및 게놈 잔류물의 무결성을 감지할 수는 없습니다.그 중 A260/280 및 A260/230은 RNA 순도 검출에 중요한 매개변수이며 값의 변동에 따라 RNA 순도를 검출할 수 있습니다.

1. 1.9< A260/280< 2.1, RNA 순도가 양호함을 나타냄;A260/280<1.9, RNA에 단백질 잔기가 있을 수 있음을 나타냄;A260/280>2.1, RNA의 부분 분해 가능성을 나타내며, 이는 아가로스 겔 전기영동으로 추가로 확인할 수 있습니다.

2. 2.0< A260/230< 2.2, RNA 순도가 양호함을 나타냄;A260/230< 2.0, RNA에 페놀, 에탄올 또는 당과 같은 유기 시약 잔류물이 있을 수 있음을 나타냅니다.

아가로스 겔 전기영동:

아가로스 겔 전기영동 분석은 RNA 무결성, 게놈 및 단백질 잔류물을 분석할 수 있지만 RNA의 농도를 정확하게 정량화하거나 유기 시약의 잔류물을 검출할 수 없습니다.진핵 RNA 템플릿을 예로 들어 보겠습니다.

1. RNA를 아가로스 겔 전기영동하였다.Gel map에 28sRNA, 18sRNA, 5.8sRNA의 3개 단일 밴드만 있다면 추출된 RNA가 손상되지 않았음을 나타냅니다.끌림 현상이 있으면 RNA의 부분적 분해를 나타냅니다.

2. 글루 홀과 28sRNA 밴드 사이에 밝은 밴드가 하나만 있으면 게놈 DNA 잔류물이 있을 수 있습니다.

3. 접착제 구멍에 밴드가 나타나면 단백질 및 기타 고분자 물질의 잔류물이 있을 수 있음을 나타냅니다.

Ⅱ. 역전사

RNA 추출이 완료되면 후속 실험을 위해 cDNA로 역전해야 하므로 역전 단계가 필수적입니다.역전사는 역전사 효소 및 프라이머의 선택으로부터 도입될 것입니다:

역전사효소 선택:

일반적인 역전사 효소에는 AMV RTase 및 MMLV RTase가 포함됩니다.AMV RTase의 RNase H는 활성이 강하고 합성 길이가 짧으며 합성량이 적고 열 안정성(42~55℃)이 좋습니다.MMLV RTase의 RNase H 활성이 약하고, 합성길이가 길고, 합성량이 많고, 열안정성이 나쁘다(37~42℃).

RNase H 효소는 RNA 주형을 분해하는 기능을 가지고 있기 때문에 역전사 과정에서 RNase H 활성이 약한 MMLV를 우선적으로 선택해야 하며 이후 유전공학을 거쳐 MMLV의 열 안정성은 질적 도약에 이르렀다.Foregene 복용Foreasy Reverse Transcriptase(역전사용 M-MLV) 예를 들어, 유전자 재조합 기술을 사용하여 대장균이 조작한 박테리아에서 발현되는 새로운 역전사 효소입니다.이것은 단일 가닥 RNA, DNA 또는 RNA:DNA 혼성체로부터 상보적인 DNA 가닥을 합성하는 재조합 DNA 중합효소입니다.RNase H 활성이 없고 안정성이 강하며 RNA 친화력이 강하고 검출 감도가 높습니다.

 

Foreasy Reverse Transcriptase(역전사용 M-MLV)

프라이머 선택:

일반적으로 RT 프라이머는 oligo dT, 랜덤 프라이머 및 유전자 특이적 프라이머의 세 가지 범주로 나뉩니다.다양한 실험 요구 사항에 따라 사용하기에 적합한 프라이머를 선택합니다.

1. 주형이 진핵세포 기원이고 후기 cDNA가 일상적인 PCR 증폭에 사용되는 경우 Oligo(dT)가 권장됩니다.후속 실험이 qPCR에만 사용되는 경우 역전사 효율을 향상시키기 위해 Oligo(dT)를 무작위 프라이머와 혼합하는 것이 좋습니다.

2. 주형이 원핵생물인 경우 역전사를 위해 Random Primers 또는 유전자 특이적 프라이머를 선택해야 합니다.

Ⅲ.정량 PCR

형광 정량은 주로 정량 방법의 선택, 프라이머 디자인 원칙, ROX 선택, 반응 시스템 구성 및 반응 조건 설정 등에서 정교합니다.

정량적 방법의 선택:

정량법은 상대정량법과 절대정량법으로 나뉜다.상대 정량화는 유전자 발현에 대한 특정 치료 방법의 효과를 검출하고, 다른 시간에 유전자 발현의 차이를 검출하고, 다른 조직에서 유전자 발현의 차이를 비교하는 데 사용할 수 있습니다.절대 정량화는 바이러스 등의 핵산 양을 감지할 수 있습니다.실험을 할 때 우리 자신의 실험에 따라 적절한 정량 방법을 선택해야 합니다.

프라이머 디자인 원칙:

qPCR을 위한 프라이머의 디자인은 증폭 효율 및 제품 특이성과 직접적인 관련이 있습니다.따라서 좋은 프라이머를 올바르게 설계하는 것이 성공적인 qPCR의 첫 번째 단계입니다.Primer 설계 시 기존의 Primer 설계 원칙을 충족할 때 다음과 같은 원칙에 유의해야 합니다.

1. 표적 절편의 길이는 100~300bp 사이에서 제어됩니다.

2. 게놈 DNA의 영향을 피하기 위한 교차 엑손 디자인;

3. 설계된 프라이머는 증폭 효율을 테스트해야 하며 증폭 효율이 기준(90-110%)에 도달해야 정량 실험에 사용할 수 있습니다.

4. Primer 농도는 일반적으로 0.1uM에서 1.0uM 사이에서 최적화됩니다.

의 선정록스:

정량 반응 과정에서 ROX는 증발 및 응축으로 인한 광경로 차이, 피펫팅 오류 또는 부피 차이를 균일하게 조정하여 결과의 ​​반복성을 향상시킬 수 있습니다.그러나 ROX의 선택은 악기와 관련이 있다는 점에 유의해야 합니다.qPCR 기기에 구멍 간 차이를 자동으로 보정하는 기능이 있는 경우 ROX를 추가할 필요가 없습니다.그렇지 않으면 ROX 보정을 추가해야 합니다.시약 구매의 소규모 파트너는 올바른 ROX를 선택하는 데 사용되는 도구에 따라야 하며 나중에 실수하지 않도록 해야 합니다.

반응 시스템의 준비:

20ul 및 50ul의 반응 부피가 선호됩니다.시스템을 공식화할 때 다음 사항에 주의해야 합니다.

1. 울트라 클린 작업대, 새로운 ddH에서 환기로 반응 시스템을 준비해야 합니다.₂O는 각 실험에 사용됩니다.

2. 각 실험은 시스템에 오염이 있는지 확인하기 위해 NTC를 준비해야 하며 시스템을 준비할 때 모든 프라이머 쌍은 NTC를 수행해야 합니다.

3. RNA 템플릿에 gDNA 잔기가 있는지 여부를 검출하기 위해 검출을 위해 각 샘플에 대해 NRT를 준비할 수 있습니다.

4. 시스템을 준비할 때 하나의 샘플에 대해 최소 3회의 기술 반복을 수행하는 것이 좋습니다.

5. template이 cDNA인 경우 qPCR 실험에서 역전사 시스템의 억제 효과를 줄이기 위해 5-10배 희석을 권장합니다.CT 값이 20-30 사이가 되도록 기울기로 템플릿 수량을 탐색하는 것이 좋습니다.

6. 필요한 반응 수를 결정하고 반응 수를 기준으로 5-10% 증가시키고 부피 구성 수를 계산합니다.

7, 시스템은 프리믹스 원리를 사용하여 준비되며, 원심분리 후 혼합하고 기포가 없도록 합니다.

8, 가능한 한 지원 소모품을 선택하십시오.

관련 RT-qPCR 키트