검출의 특이성
대부분의 경우 프라이머 디자인의 목적은 PCR의 특이성을 극대화하는 것입니다.이것은 많은 변수의 예측 가능한 영향에 의해 결정됩니다.한 가지 중요한 변수는 프라이머의 3' 말단에 있는 서열입니다.
중요한 것은 특이성을 위해 설계된 PCR 분석은 분석이 비특이적 증폭 산물을 생성하지 않아 PCR 시약과 경쟁하거나 주요 증폭 반응을 억제하기 때문에 넓은 동적 범위에서 높은 효율성을 유지할 가능성이 더 높다는 것입니다.
물론 어떤 경우에는 특이성이 가장 중요하지 않습니다. 예를 들어 밀접하게 관련되어 있지만 다른 병원체를 정량화하는 것이 목표인 경우 특수 설계, 최적화 및 검증 표준이 필요합니다.
용융 곡선은 적어도 단일 표적을 증폭할지 여부와 관련하여 앰플리콘의 특이성을 평가하기 위한 표준 방법입니다.그러나 용융 곡선은 예를 들어 최적이 아닌 프라이머와 낮은 주형 농도의 조합 효과에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에 오해의 소지가 있을 수 있다는 점을 강조해야 합니다.
P5 |용융 곡선은 서로 다른 양의 두 표적 DNA를 두 번 검출하여 얻은 Tm 이동을 보여줍니다.
A. 더 높은 농도(ad)에서는 qPCR 측정이 완료된 후 명백한 primer dimer가 없습니다.템플릿 농도가 50카피로 감소함에 따라(e) 비특이적인 제품이 나타나기 시작하여 가장 낮은 농도(f)에서 유일한 제품이 됩니다.
B. 테스트는 모든 목표 농도에서 동일한 Tms를 기록했으며, 가장 낮은 농도(5 copies)에서도 명백한 프라이머 이량체가 없었습니다.이 두 가지 검출 방법을 사용할 때 NTC에서 증폭 산물이 검출되지 않았습니다.
P5는 템플릿이 다른 농도로 존재하는 샘플로 얻은 용해 곡선을 보여줍니다.P 5a는 두 개의 가장 낮은 농도에서 생성된 비특이적 증폭 산물의 Tms가 특정 앰플리콘의 Tms보다 낮다는 것을 보여줍니다.
분명히, 이 검출 방법은 저농도에 존재하는 표적을 검출하는 데 안정적으로 사용할 수 없습니다.
흥미롭게도, NTC, 즉 DNA가 전혀 없는 샘플은 (비특이적) 증폭 산물을 기록하지 않았으며, 이는 배경 게놈 DNA가 비특이적 증폭/중합에 참여할 수 있음을 나타냅니다.
때로는 이러한 백그라운드 프라이머와 비특이적 증폭을 해결할 수 없지만 어떤 템플릿 농도와 NTC에서도 비특이적 증폭이 없는 검출 방법을 설계하는 것이 종종 가능합니다(P 5b).
여기에서 Cq가 35인 목표 농도의 증폭을 기록하더라도 특정 용해 곡선이 생성됩니다.유사하게, NTC는 비특이적 증폭의 징후를 보이지 않았습니다.때로는 검출 거동이 모액에 따라 달라질 수 있으며 특정 버퍼 구성에서 비특이적 증폭만 검출되며 이는 다른 Mg2+ 농도와 관련될 수 있습니다.
검출의 안정성
Ta의 최적화는 qPCR 검출의 경험적 검증 및 최적화 프로세스에서 유용한 단계입니다.NTC를 증폭하지 않고 가장 낮은 Cq를 생성하는 온도(또는 온도 범위)를 표시하여 프라이머 세트의 견고성을 직접적으로 나타냅니다.
민감도의 2~4배 차이는 mRNA 발현이 높은 사람에게는 중요하지 않을 수 있지만 진단 테스트의 경우 양성 결과와 위음성 결과의 차이를 의미할 수 있습니다.
qPCR 프라이머의 Ta 특성은 크게 다를 수 있습니다.일부 테스트는 그다지 견고하지 않으며 프라이머의 최적 Ta 값에서 수행되지 않으면 빠르게 붕괴됩니다.
이러한 유형의 감지는 현실 세계에서 종종 문제가 되고 샘플의 순도, DNA 농도 또는 다른 DNA의 존재가 최적이 아닐 수 있기 때문에 중요합니다.
또한 표적 카피 수는 광범위하게 다를 수 있으며 시약, 플라스틱 도구 또는 기구는 테스트를 설정할 때 사용된 것과 다를 수 있습니다.
P6|온도 구배는 PCR 검출의 다른 견고성을 보여줍니다.
A. Bioline의 Sensifast SYBR mastermix(카탈로그 번호 BIO-98050)를 사용하여 인간 뇌 RNA에서 준비된 cDNA에서 PCR을 수행합니다.
B. Bio-Rad의 CFX qPCR 기기를 사용하여 아팔렌(NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCTAGG)의 증폭 지도와 용해 곡선을 기록합니다.
C. ACSBG1(NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG)의 증폭 그래프 및 용융 곡선.
D. GFAP(NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC)의 증폭 그래프 및 용해 곡선.
E. 서로 다른 어닐링 온도에서 기록된 Cq는 7C 온도 구배에서 기록된 Cq의 차이를 나타냅니다.
P 6은 3개의 인간 뇌-특이 유전자에 대한 프라이머를 사용하여 59C와 67C 사이의 기울기 Tas(P 6a)를 사용하여 qPCR을 수행한 바람직하지 않은 테스트의 전형적인 결과를 보여줍니다.
Opalin 프라이머는 최적의 Ta 범위가 매우 좁기 때문에(그림 6b), 즉 Cq가 광범위하게 분산되어 Cq가 최적의 Cqs Low와 크게 비교되기 때문에 증폭 그래프에서 볼 수 있습니다.
이 검출 방법은 불안정하며 최적이 아닌 증폭으로 이어질 수 있습니다.따라서 이 프라이머 쌍을 재설계해야 합니다.또한 용융 곡선 분석(삽입)은 각 Ta의 용융 곡선이 다르기 때문에 이 검출 방법의 특이성도 문제가 될 수 있음을 보여줍니다.
P 6c에 표시된 ACSBG1 감지 방법은 위의 Opalin 감지 방법보다 더 견고하지만 여전히 이상적이지 않으며 개선될 가능성이 있습니다.
그러나 이 검출 방법에 의해 생성된 용출 곡선이 모든 Tas(삽입)에서 동일한 피크 값을 나타내기 때문에 견고성과 특이성 사이에 필요한 연결이 없음을 강조합니다.
반면에 견고성 테스트는 P 6d에 표시된 GFAP 테스트에서와 같이 광범위한 Tas에서 유사한 Cq를 생성하여 훨씬 더 관대합니다.
동일한 섭씨 8도 범위에서 얻은 Cqs의 차이는 1 미만이며 용해 곡선(삽입)은 이 온도 범위에서 검출 특성을 확인합니다.계산된 Tas와 실제 Ta 범위는 매우 다를 수 있습니다.
연구자들이 효율적인 프라이머를 설계하는 데 도움이 되도록 고안된 많은 지침이 있으며, 그 대부분은 오랫동안 확립된 규칙을 기반으로 하며 프라이머의 3' 말단에 많은 주의를 기울였습니다.3' 말단에 G 또는 C를 포함하고 두 개의 G 또는 C 베이스(GC 클램프)를 포함하는 것이 종종 권장되지만 마지막 5개 베이스 중 두 개 이하입니다.
실제로 이러한 규칙은 연구자를 안내할 수 있지만 모든 상황에서 반드시 올바른 것은 아닙니다.
P7 |프라이머의 3' 말단은 특이성이나 효율성에 거의 영향을 미치지 않습니다.
A. 인간 HIF-1α(NM_181054.2) 유전자에 대한 프라이머의 위치.
B. Agilent Brilliant III SYBR Green 모액(Cat. No. 600882)을 사용하여 6개의 테스트 항목을 증폭합니다.
C. Bio-Rad의 CFX qPCR 기기 및 3'end 프라이머에 의해 기록된 증폭 그래프 및 용융 곡선.NTC는 빨간색으로 표시됩니다.
D. 각 시험 항목의 Cqs 기록
예를 들어, P 7의 결과는 3'end 규칙과 모순됩니다.모든 설계는 NTC에서 비특이적 증폭으로 이어지는 단 두 개의 프라이머 조합으로 기본적으로 동일한 결과를 생성합니다.
그러나 GC 클립의 효과는 지원할 수 없습니다. 이 경우 A 또는 T를 최대 30개의 염기로 사용해도 특이성이 감소하지 않기 때문입니다.
F 프라이머가 GGCC에서 끝나는 테스트 C는 NTC에 Cq를 기록했는데, 이는 30-말단에서 이러한 시퀀스를 피하고 싶을 수도 있음을 나타냅니다.프라이머 쌍의 최상의 3' 말단 서열을 결정하는 유일한 방법은 일부 후보 프라이머를 실험적으로 평가하는 것임을 강조합니다.
증폭 효율
중요한 것은 비특이적 PCR 검출이 특정화될 수는 없지만 효소, 모액, 첨가제 및 순환 조건을 변경하여 다양한 방법으로 증폭 효율을 조정하고 극대화할 수 있다는 것입니다.
PCR 검출의 효율을 평가하기 위해서는 표적 핵산의 10배 또는 5배의 연속 희석, 즉 "표준 곡선법"을 사용하는 것이 가장 좋습니다.
PCR 앰플리콘 또는 합성 DNA 표적을 사용하여 표준 곡선을 생성하는 경우 이러한 표적의 연속 희석액을 일정한 양의 배경 DNA(예: 게놈 DNA)와 혼합해야 합니다.
P8 |PCR의 효율성을 평가하기 위한 희석 곡선.
A. HIF-1용 프라이머 사용: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA 및 R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC 및 Agilent의 Brilliant III SYBR Green mastermix(카탈로그 번호 600882)를 PCR 및 용융 곡선 조건에 사용합니다.
B. 100ng RNA를 역전사하고, 2배 희석하고, 연속 희석된 cDNA 샘플을 1ng 인간 게놈 DNA로 5배 희석했습니다.용융 곡선은 삽화에 표시됩니다.
C. RT 반응, 희석 및 연속 희석은 두 번째 cDNA 샘플에 대해 반복되었으며 결과는 유사했습니다.
P 8은 두 개의 다른 cDNA 샘플에서 동일한 검출 방법을 사용하는 두 개의 표준 곡선을 보여줍니다. 결과는 약 100%로 동일한 효율성이며 R2 값도 유사합니다. 즉, 실험 데이터와 회귀선 또는 데이터 간의 적합도 선형성 정도입니다.
두 표준 곡선은 비슷하지만 완전히 동일하지는 않습니다.목적이 대상을 정확하게 정량화하는 것이라면 불확실성을 설명하지 않고 사본 수 계산을 제공하는 것은 허용되지 않는다는 점에 유의해야 합니다.
P9 |표준 곡선을 사용한 정량화와 관련된 측정 불확실성.
A. GAPDH용 프라이머(NM_002046)를 사용하여 PCR 및 용융 곡선 조건을 수행합니다.F: ACAGTTGCCATGTAGACC 및 R: TAACTGGTTGAGCACAGG 및 Bioline의 Sensifast SYBR 마스터믹스(카탈로그 번호 BIO-98050).
B. Bio-Rad의 CFX qPCR 기기로 기록된 증폭 차트, 용융 곡선 및 표준 곡선.
C. 표준 곡선 그래프 및 95% 신뢰 구간(CI).
D. 희석 곡선에서 파생된 세 가지 Cq 값의 복제 수 및 95% 신뢰 구간.
P 9는 최적화된 테스트의 경우 단일 표준 곡선의 고유 변동성이 약 2배(95% 신뢰 구간, 최소에서 최대까지)이며, 이는 예상할 수 있는 가장 작은 변동일 수 있음을 보여줍니다.
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게시 시간: 2021년 9월 30일
