피펫 팁 및 EP 튜브 등의 멸균

1. 탈이온수로 0.1%(1000분의 1) DEPC(고독성 물질)를 준비하고 흄 후드에서 조심스럽게 사용하고 빛에서 4°C 떨어진 곳에 보관합니다.

DEPC수는 DEPC로 처리하여 고온, 고압으로 살균한 순수한 물입니다.RNase, DNase 및 proteinase가 없는 것으로 테스트되었습니다.

2. 피펫 팁과 EP 튜브를 0.1% DEPC에 넣고 피펫 팁과 EP 튜브가 0.1% DEP로 채워져 있는지 확인합니다.

3. 빛으로부터 보호하고 밤새 그대로 둡니다(12-24시간).

4. 팁과 EP 튜브가 들어 있는 상자는 DEPC에 담글 필요가 없습니다.Tip 또는 EP Tube 내부의 DEPC water를 대충 제거한 후, 포장하여 포장한다.

5. 섭씨 121도, 30분

6. 섭씨 180도, 몇 시간 건조(최소 3시간)

참고:DEPC를 취급할 때는 라텍스 장갑과 마스크를 착용하십시오!b, 또는 DEPC 멸균 없이, 130℃, 90분 오토클레이브(많은 실험실에서 2회 고온 멸균)

RNA 추출 고려 사항

조직 RNA 분리 실패의 두 가지 주요 현상

조직 내 RNA 분해 및 불순물 잔류물,분해에 관해서는 먼저 배양 세포에서 추출한 RNA가 쉽게 분해되지 않는 이유를 살펴보겠습니다.기존의 RNA 추출 시약은 모두 RNase를 빠르게 억제하는 성분을 포함하고 있습니다.배양된 세포에 lysate를 넣고 섞기만 하면 모든 세포가 lysate와 완전히 섞일 수 있으며, 세포가 완전히 용해됩니다.세포가 용해된 후 용해물의 활성 성분이 즉시 세포 내 RNase를 억제하므로 RNA는 그대로 유지됩니다.즉, 배양된 세포는 용해물과 쉽고 완전히 접촉하기 때문에 RNA가 쉽게 분해되지 않습니다.한편, 조직 내 RNA는 조직 내 세포가 용해물과 빠르게 접촉하기 쉽지 않기 때문에 쉽게 분해된다.충분한 접촉으로 인해그래서,RNA 활동을 억제하면서 조직을 단일 세포로 전환하는 방법이 있다고 가정하면 분해 문제를 완전히 해결할 수 있습니다.

액체 질소 밀링은 가장 효과적인 방법입니다.그러나 액체 질소 밀링 방법은 특히 샘플 수가 많을 때 매우 번거롭습니다.이것이 차선책인 균질화 장치를 탄생시켰습니다.그만큼균질화기방법은 세포가 용해물과 접촉하기 전에 RNase 활성이 어떻게 억제되는지에 대한 질문을 고려하지 않고 오히려 조직 파괴 속도가 세포 내 RNase가 RN을 분해하는 속도보다 빠르기를 기도합니다.

전기 균질화기의 효과가 더 좋고,유리 균질기의 효과는 좋지 않지만 일반적으로 균질기 방법은 열화 현상을 방지할 수 없습니다.따라서 추출이 저하되면 원래의 전기 균질기를 사용하여 액체 질소로 분쇄해야 합니다.원래의 유리 균질기는 전기 균질기로 변경하거나 액체 질소로 직접 밀링해야 합니다.문제는 거의 100% 가능합니다.해결하십시오.

후속 실험에 영향을 미치는 불순물 잔류물 문제는 분해보다 더 다양한 원인이 있으며 그에 따라 해결 방법도 다릅니다.결론적으로,조직에 분해 또는 잔여 불순물이 있는 경우 특정 실험 물질에 대한 추출 방법/시약을 최적화해야 합니다.최적화를 위해 소중한 샘플을 사용할 필요가 없습니다. 시장에서 생선/닭과 같은 작은 동물을 구입하고 RNA 추출을 위한 재료의 해당 부분과 단백질 추출을 위한 다른 부분을 가져갈 수 있습니다.

추출된 RNA의 target RNA는 다른 후속 실험에 사용되며 품질 요구 사항이 다릅니다.

cDNA 라이브러리 구성에는 효소 반응 억제제의 잔류물 없이 RNA 무결성이 필요합니다.Northern은 더 높은 RNA 무결성을 요구하고 효소 반응 억제제 잔류물에 대한 더 낮은 요구 사항을 요구합니다.RT-PCR은 너무 높은 RNA 무결성을 요구하지 않으며,그러나 효소 반응을 억제합니다.잔류 요구 사항은 엄격합니다.입력이 출력을 결정합니다.목표가 최고 순도의 RNA를 얻는 것일 때마다 사람과 비용이 들 것입니다.

샘플 수집/보관

분해에 영향을 미치는 요인 샘플이 생체/또는 원래 성장 환경을 떠난 후 샘플의 내인성 효소가 RNA를 분해하기 시작합니다.분해율은 내인성 효소의 함량 및 온도와 관련이 있다.전통적으로 내인성 효소 활동을 완전히 억제하는 방법은 두 가지뿐입니다. 용해물을 즉시 추가하고 철저하고 신속하게 균질화합니다.작은 조각으로 자르고 즉시 액체 질소에서 동결하십시오.두 접근 방식 모두 빠른 작동이 필요합니다.후자는 모든 샘플에 적합하지만 전자는 세포 및 내인성 효소 함량이 낮고 균질화하기 쉬운 조직에만 적합합니다.구체적으로, 식물 조직, 간, 흉선, 췌장, 비장, 뇌, 지방, 근육 조직 등은 진행하기 전에 액체 질소로 동결하는 것이 가장 좋습니다.

시료의 단편화 및 균질화

열화 및 수율에 영향을 미치는 요인 샘플 조각화는철저한 균질화를 위해, 이는 RNA의 완전하고 완전한 방출을 위한 것입니다.세포는 깨지지 않고 직접 균질화될 수 있습니다.조직은 부서진 후에만 균질화될 수 있습니다.효모와 박테리아는 균질화되기 전에 상응하는 효소로 분해되어야 합니다.내인성 효소 함량이 낮고 균질화가 더 쉬운 조직은 균질화기에 의해 용해물에서 한 번에 분쇄되고 균질화될 수 있습니다.식물 조직, 간, 흉선, 췌장, 비장, 뇌, 지방, 근육 조직 및 기타 샘플, 이들은 내인성 효소가 높거나 쉽게 균질화되지 않으며,따라서 조직 파쇄와 균질화를 별도로 수행해야 합니다..가장 신뢰할 수 있고 가장 생산적인 조각화 방법은 액체 질소로 밀링하는 것이며 가장 신뢰할 수 있는 균질화 방법은 전기 균질기를 사용하는 것입니다.액체 질소를 사용한 제분에 대한 특별 참고 사항: 내인성 효소는 냉동 상태에서 기능할 가능성이 높기 때문에 전체 제분 과정 중에 샘플을 해동해서는 안 됩니다.

용해물의 선택

작업 편의성 및 잔류 내인성 불순물 요인에 영향 일반적으로 사용되는 용해 용액은 RNase의 활성을 거의 억제할 수 있습니다.따라서 lysis 용액 선택의 핵심은 정제 방법과의 조합을 고려하는 것입니다.한 가지 예외가 있습니다.내인성 효소 함량이 높은 샘플은 내인성 효소를 비활성화하는 능력을 높이기 위해 페놀이 포함된 용해물을 사용하는 것이 좋습니다.

정화 방법 선택

잔류 내인성 불순물, 추출 속도에 영향을 미치는 요인 세포와 같은 깨끗한 시료의 경우 거의 모든 정제 방법으로 만족스러운 결과를 얻을 수 있습니다.그러나 다른 많은 샘플, 특히 식물, 간, 박테리아 등과 같은 불순물이 높은 샘플의 경우 적절한 정제 방법을 선택하는 것이 중요합니다.컬럼 원심분리 정제 방식은 추출 속도가 빠르고 RNA의 후속 효소 반응에 영향을 미치는 불순물을 효과적으로 제거할 수 있지만 비용이 많이 듭니다(Foregene은 비용 효율적인 키트를 제공할 수 있습니다.여기);LiCl 침전과 같은 경제적이고 고전적인 정제 방법을 사용해도 만족스러운 결과를 얻을 수 있지만 작업 시간이 길다..

RNA 추출을 위한 "3가지 분야와 8가지 주의"

분야 1:외인성 효소의 오염을 종식시킵니다.

참고 1:마스크와 장갑을 철저히 착용하십시오.

노트 2:실험에 사용되는 원심분리기 튜브, 팁 헤드, 피펫 막대, 전기영동 탱크, 실험대는 철저히 폐기해야 합니다.

노트 3:실험에 사용되는 시약/용액, 특히 물은 RNase가 없어야 합니다.

원칙 2:내인성 효소의 활성 차단

참고 4:적절한 균질화 방법을 선택합니다.

참고 5:적절한 용해물을 선택합니다.

참고 6:샘플의 시작 양을 제어합니다.

원칙 3:추출 목적을 명확히 하십시오.

참고 7:모든 lysate 시스템이 샘플의 최대 시작 양에 접근하면 추출 성공률이 급격히 떨어집니다.

참고 8:성공적인 RNA 추출을 위한 유일한 경제적 기준은 수율이 아니라 후속 실험에서의 성공입니다.

RNase 오염의 상위 10개 소스

1. 손가락은 외인성 효소의 첫 공급원이므로 장갑을 자주 착용하고 교체해야 합니다.또한 호흡도 중요한 효소 공급원이기 때문에 마스크도 반드시 착용해야 합니다.장갑 마스크 착용의 또 다른 이점은 실험자를 보호하는 것입니다.

2. 피펫 팁, 원심 분리기 튜브, 피펫 - RNase는 멸균만으로는 비활성화될 수 없으므로 피펫 팁과 원심 분리기 튜브는 DEPC 처리로 표시되어 있더라도 DEPC로 처리해야 합니다.특수 목적 피펫을 사용하는 것이 가장 좋습니다. 사용하기 전에 75% 알코올 면봉, 특히 막대로 닦으십시오.또한 헤드 리무버를 사용하지 마십시오.

3. 물/완충액은 RNase 오염이 없어야 합니다.

4. 적어도 테스트 테이블은 75% 알코올 면봉으로 깨끗이 닦아야 합니다.

5.내인성 RNase 모든 조직에는 내인성 효소가 포함되어 있으므로 액체 질소로 조직을 급속 동결시키는 것이 분해를 줄이는 가장 좋은 방법입니다.액체질소 저장/분쇄 방식은 참으로 불편하지만, 내인성 효소 수치가 높은 조직에 사용할 수 있는 유일한 방법입니다.

6. RNA 샘플 RNA 추출 제품은 RNase 오염의 흔적을 포함할 수 있습니다.

7. 플라스미드 추출 플라스미드 추출은 Rnase를 사용하여 RNA를 분해하는 경우가 많으며, 잔여 Rnase는 Proteinase K로 분해하여 PCI로 추출해야 합니다.

8. RNA 보관 저온에서 보관하더라도 미량의 RNase가 RNA 분해를 일으킵니다.RNA의 장기 보존을 위한 최상의 솔루션은 염/알코올 현탁액입니다. 알코올은 저온에서 모든 효소 활성을 억제하기 때문입니다.

9. 양이온(Ca, Mg)에 이러한 이온이 포함되어 있을 때 80C에서 5분간 가열하면 RNA가 절단되므로 RNA를 가열해야 하는 경우 보존액에 킬레이트제(1mM Sodium Citrate, pH 6.4)를 함유해야 합니다.

10. 후속 실험에 사용되는 효소는 RNase에 의해 오염될 수 있습니다.

RNA 추출을 위한 10가지 팁

1: RNase 활성을 빠르게 방지합니다.샘플은 수집 후 빠르게 동결되며 RNase는 용해 중에 빠른 작동으로 비활성화됩니다.

2: 리보자임 함량이 높은 조직에 적합한 추출 방법을 선택하고 지방 조직은 페놀을 함유한 방법을 사용하는 것이 가장 좋습니다.

3: 예측 품질에는 Northern이 필요하고 cDNA 라이브러리 구성에는 높은 무결성이 필요하며 RT-PCR 및 RPA(Ribonuclease protection assay)에는 높은 무결성이 필요하지 않습니다.RT-PCR은 고순도(효소 억제제 잔류물)가 필요합니다.

4: 철저한 균질화는 수율 향상과 열화 감소의 핵심입니다.

5: RNA 전기영동 검출의 무결성을 확인합니다. 28S:18S = 2:1은 완전한 신호이며, 1:1도 대부분의 실험에 허용됩니다.

6: RT-PCR을 위한 DNA 제거, 어레이 분석 DNA를 제거하기 위해서는 Dnase I을 사용하는 것이 가장 좋습니다.

7: 외인성 효소의 오염을 줄입니다. 효소는 외부에서 수입할 수 없습니다.

8: 저농도 핵산을 농축할 때 공침 시약을 추가해야 합니다.그러나 효소와 DNA 오염을 포함하는 공침전을 방지합니다.

9: RNA를 완전히 녹이고, 필요하다면 65C에서 5분간 가열한다.

적절한 보관 방법

-20C에서 단시간, -80C에서 장기간 보관할 수 있습니다.RNA 수율을 개선하는 첫 번째 단계는 서로 다른 샘플의 RNA 함량이 크게 다르다는 것을 깨닫는 것입니다.간, 췌장, 심장과 같은 높은 풍부(2-4ug/mg), 뇌, 배아, 신장, 폐, 흉선, 난소와 같은 중간 풍부(0.05-2ug/mg), 방광, 뼈, 지방과 같은 낮은 풍부(<0.05ug/mg) mg).

1: RN을 방출하기 위해 세포를 용해 – RNA가 방출되지 않으면 수율이 감소합니다.전기 균질화는 다른 균질화 방법보다 더 잘 작동하지만 액체 질소 매싱, 효소 소화(Lysozyme/Lyticase)와 같은 다른 방법과 결합해야 할 수도 있습니다.

2: 추출 방법의 최적화.페놀 기반 방법의 가장 큰 문제는 불완전한 계층화 및 부분적인 RNA 손실(상등액을 완전히 제거할 수 없음)입니다.불완전한 계층화는 핵산 및 단백질 함량이 높기 때문에 사용되는 lysate의 양을 늘리거나 시료의 양을 줄임으로써 해결할 수 있습니다.지방 조직에 클로로포름 추출 단계가 추가되었습니다.RNA 손실은 back-pumping 또는 유기층을 제거한 다음 원심분리하여 줄일 수 있습니다.컬럼 원심분리 기반 방법의 가장 큰 문제는 과도한 시료입니다.

클래식 추출 팁

1. 페놀 정제: 동일한 부피의 1:1 페놀/클로로포름을 첨가하고 1-2분 동안 격렬하게 혼합합니다.2분 동안 고속으로 원심분리합니다.상층액(80-90%)을 조심스럽게 제거합니다.중간층에 절대 가지 마세요.동량의 반응 용액을 페놀/클로로포름에 첨가하고 상청액을 제거할 수 있습니다.수율을 향상시키기 위해 핵산 침전을 위해 두 개의 상청액을 함께 혼합할 수 있습니다.혼합할 때 너무 부드럽게 섞지 말고 상층액을 모두 제거하려고 하지 마십시오.

2. 70-80% 에탄올로 세척: 세척하는 동안 잔류 염이 씻겨 나가도록 핵산을 부유시켜야 합니다.동시에 에탄올을 쏟은 직후에 고속으로 몇 초간 원심분리한 후 피펫으로 잔류 에탄올을 제거한다.실온에서 5~10분 방치 후 녹입니다.

11. 특수조직의 추출

1. 섬유조직: 심장/골격근과 같은 섬유조직에서 RNA 추출의 핵심은 조직을 완전히 파괴하는 것입니다.이러한 조직은 세포 밀도가 낮아 조직 단위 중량당 RNA의 양이 적고 시작량은 최대한 많이 사용하는 것이 가장 좋습니다.동결 조건에서 티슈를 철저히 연마하십시오.

2. 단백질/지방 함량이 높은 조직: 뇌/식물성 지방 함량이 높습니다.PCI 추출 후 상층액에는 흰색 응집체가 포함되어 있습니다.상등액은 클로로포름으로 다시 추출해야 합니다.

3. 핵산/리보자임 함량이 높은 조직: 비장/흉선은 핵산 및 리보자임 함량이 높습니다.냉동 조건에서 조직을 분쇄한 후 신속한 균질화를 수행하면 리보자임을 효과적으로 비활성화할 수 있습니다.그러나 lysate가 너무 점성이 있는 경우(높은 핵산 함량으로 인해) PCI 추출은 효과적으로 계층화할 수 없습니다.용해물을 더 추가하면 이 문제를 해결할 수 있습니다.다중 PCI 추출은 더 많은 잔여 DNA를 제거할 수 있습니다.알코올을 첨가한 직후 흰색 침전물이 형성되면 DNA 오염을 나타냅니다.용해 후 산성 PCI로 재추출하면 DNA 오염을 제거할 수 있습니다.

4. 식물 조직: 식물 조직은 동물 조직보다 더 복잡합니다.일반적으로 식물은 액체 질소 조건에서 분쇄되므로 내인성 효소에 의한 RNA 분해는 흔하지 않습니다.열화 문제가 해결되지 않는다면 시료에 포함된 불순물에 의한 것이 거의 확실합니다.많은 식물에 포함된 불순물은 잔류물로 이어지며 잔류물의 원인은 종종 이러한 불순물이 RNA와 유사하기 때문입니다.이러한 특성은 매우 강력한 효소 억제제임을 결정합니다.

현재 상업용 RNA 추출 시약은 약간의 조정으로 거의 모든 동물 조직에 적용할 수 있지만 대부분의 식물 조직에 적합할 수 있는 상업용 RNA 추출 시약은 거의 없습니다.다행스럽게도 Foregene은 특별한식물 RNA 추출 키트, 우리는Plant Total RNA 분리 키트, Plant Total RNA 분리 키트 플러스.후자는 다당류와 폴리페놀 함량이 높은 식물을 위해 특별히 설계되었습니다.RNA 추출의 경우 실험실 사용자의 피드백이 특히 좋습니다.

12. 샘플 동결 및 해동 효과 동결된 샘플은 크기가 클 수 있으며 RNA 추출에 사용하기 전에 절단해야 합니다.샘플은 절단 중에 녹는 경향이 있습니다(아마도 부분적으로).냉동된 샘플은 RNA 추출 전에 무게를 측정해야 할 수 있으며 해동은 이 과정에서 확실히 발생합니다.때로는 샘플의 해동이 액체 질소 분쇄 공정 중에도 발생합니다.또는 동결된 샘플이 액체 질소 밀링 없이 용해물에 직접 추가되며 해동은 완전한 균질화 전에 확실히 발생합니다.실험에 따르면 냉동 조직은 신선한 조직보다 해동 중에 RNA 분해에 더 취약한 것으로 나타났습니다.가능한 이유: 동결-해동 과정은 세포 내의 구조를 파괴하여 내인성 효소가 RNA와 직접 접촉하기 쉽게 만듭니다.

13. RNA 품질 판단 일반적으로 RNA의 무결성을 판단하기 위해 전기영동을 사용하고, RNA의 순도를 판단하기 위해 A260/A280을 사용합니다.이론적으로 온전한 RNA는 28S:18S = 2.7:1의 비율을 가지며 대부분의 데이터는 28S:18S = 2:1의 비율을 강조합니다.사실 세포 이외의 샘플에서 추출한 RNA는 거의 2:1 비율이 아닙니다(Agilent Bioanalyzer를 사용하여 얻은 것임).

RNA의 전기영동 결과는 2차 구조, 전기영동 조건, 샘플 부하, EB에 의한 포화 정도 등 많은 요인의 영향을 받습니다. 기본 전기영동을 사용하여 RNA를 검출하고 DNA 마커를 대조군으로 사용합니다.2kb에서 28S와 0.9kb에서 18S가 명확하고 28S:18S > 1이면 무결성이 대부분의 후속 실험의 요구 사항을 충족할 수 있습니다.

A260/A280은 많은 혼란을 야기한 지표입니다.우선, 핵산에 대한 이 지표의 원래 의미를 명확히 할 필요가 있습니다: 순수 RNA, A260/280 = 약 2.0.순수 RNA가 '원인'이고 A260/A280 = 2가 '결과'입니다.지금은 다들 A260/A280을 '원인'으로 삼고 "만약 A260/A280 = 2라면 RNA는 순수하다"고 생각하고 있어 자연스레 혼란에 빠지게 된다.

관심이 있으신 분은 페놀, 구아니딘 이소티오시아네이트, PEG 등 추출에 자주 사용되는 약간의 시약을 RNA 샘플에 첨가한 후 A260/A280 비율을 측정할 수 있습니다.실제로 RNA 추출에 사용되는 많은 시약과 샘플의 많은 불순물은 A260 및 A280 주변을 흡수하여 A260/A280에 영향을 미칩니다.

현재 가장 유익한 접근 방식은 200-300nm 범위에서 RNA 샘플을 스캔하는 것입니다.순수 RNA의 곡선은 다음과 같은 특징을 가지고 있습니다: 곡선이 매끄럽고, A230과 A260은 두 개의 변곡점이며, A300은 0에 가깝고, A260/A280 = 약 2.0, A260/A230 = 약 2.0입니다.스캔 데이터를 사용할 수 없는 경우 A260/A230 비율도 결정해야 합니다. 이 비율은 효소 반응에 영향을 미치는 모든 불순물의 이월에 더 민감하기 때문입니다.장치의 선형 범위를 고려하십시오(A260의 경우 0.1–0.5).

두 가지 다른 유용한 현상이 있습니다. A260/A280이 물에서 측정될 때 비율은 약 0.3 더 낮습니다.10mM EDTA에서 측정된 비율은 1mM EDTA에서 측정된 비율보다 약 0.2 더 높습니다.

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