형광 정량 PCR(TaqMan PCR이라고도 함, 이하 FQ-PCR)은 1995년 미국 PE(Perkin Elmer)에서 개발한 새로운 핵산 정량 기술입니다.Flexible PCR에 비해 FQ-PCR은 정량적 기능을 구현하는 데 많은 장점이 있습니다.이 기사에서는 기술의 특성, 원리, 방법 및 응용 프로그램에 대해 간략하게 설명합니다.

1 특징

FQ-PCR은 일반 PCR의 높은 감도를 가질 뿐만 아니라 형광 프로브를 적용하기 때문에 광전 전도 시스템을 통해 PCR 증폭 시 형광 신호의 변화를 직접 감지하여 정량적 결과를 얻을 수 있어 기존 PCR의 많은 단점을 극복하여 DNA 혼성화의 높은 특이성과 분광 기술의 높은 정확도를 가지고 있습니다.

예를 들어 일반적인 PCR 산물은 자외선을 이용한 agarose gel 전기영동과 ethidium bromide 염색 또는 polyacrylamide gel 전기영동과 silver 염색으로 관찰해야 합니다.이를 위해서는 여러 장비가 필요할 뿐만 아니라 시간과 노력도 필요합니다.Ethidium bromide에 사용된 얼룩은 인체에 유해하며 이러한 복잡한 실험 절차는 오염 및 위양성(false positive)의 기회를 제공합니다.그러나 FQ-PCR은 샘플 로딩 중 뚜껑을 한 번만 열면 되고, 후속 공정은 완전히 폐쇄된 튜브 작업으로 PCR 후처리가 필요하지 않아 기존 PCR 작업의 많은 단점을 피할 수 있습니다.실험은 일반적으로 PE사에서 개발한 ABI7100 PCR Thermal Cycler를 사용한다.

이 장비는 다음과 같은 특징이 있습니다. ① 광범위한 적용: DNA 및 RNA PCR 산물 정량화, 유전자 발현 연구, 병원체 검출 및 PCR 조건 최적화에 사용할 수 있습니다.② 고유한 정량 원리: 형광 표지된 프로브를 사용하면 레이저 여기 후 PCR 주기와 함께 형광 양이 축적되어 정량 목적을 달성합니다.③ 높은 작업 효율: 내장된 9600 PCR 열 순환기, 컴퓨터 제어 1~2시간으로 96개 샘플의 증폭 및 정량을 자동으로 동시에 완료합니다.④ 겔 전기영동 불필요 : 시료를 희석하여 전기영동할 필요 없이 특수 프로브를 사용하여 반응관에서 직접 검출합니다.⑤파이프라인의 오염 없음: 독특한 완전 밀폐형 반응 튜브와 광전 전도 시스템이 채택되어 오염에 대해 걱정할 필요가 없습니다.⑥ 결과는 재현 가능합니다. 정량적 동적 범위는 최대 5배입니다.따라서 이 기술이 성공적으로 개발된 이후로 많은 과학 연구자들의 평가를 받으며 많은 분야에 적용되고 있습니다.

2 원칙 및 방법

FQ-PCR의 작동 원리는 Taq 효소의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 사용하여 형광 표지된 프로브를 PCR 반응 시스템에 추가하는 것입니다.프로브는 프라이머 서열에 포함된 DNA 주형과 특이적으로 혼성화할 수 있습니다.프로브의 5'말단에는 형광 방출 유전자 FAM(6-carboxyfluorescein, 518nm에서 형광 방출 피크)으로 표지되고, 3' 말단에는 형광 소광기 TAMRA(6-카르복시테트라메틸로다민, 582nm에서 형광 방출 피크)로 표지되며, 프로브의 3' 말단은 인산화되어 PCR 증폭 동안 프로브가 신장되는 것을 방지한다.프로브가 손상되지 않은 상태로 유지되면 소광제 그룹이 방출 그룹의 형광 방출을 억제합니다.Emitting group이 quenching group에서 분리되면 억제가 해제되고 518nm에서의 optical density가 증가하여 형광 검출 시스템에 의해 검출됩니다. renaturation 단계에서 probe는 template DNA와 혼성화되고 extension 단계의 Taq 효소는 primer의 extension과 함께 DNA template를 따라 이동합니다.프로브가 끊어지면 소광 효과가 해제되고 형광 신호가 해제됩니다.템플릿이 복사될 때마다 형광 신호 방출과 함께 프로브가 차단됩니다.방출된 형광단의 수와 PCR 산물의 수 사이에는 일대일 관계가 있기 때문에 이 기술을 사용하여 템플릿을 정확하게 정량화할 수 있습니다.실험기기는 일반적으로 PE사에서 개발한 ABI7100 PCR Thermal Cycler를 사용하며, 다른 Thermal Cycler도 사용할 수 있다.실험에 ABI7700 반응형 반응 시스템을 사용하면 반응이 완료된 후 컴퓨터 분석을 통해 정량 결과를 직접 얻을 수 있습니다.다른 Thermal Cycler를 사용하는 경우 RQ+, RQ-, △RQ를 계산하기 위해 동시에 반응관에서 형광 신호를 측정하기 위해 형광 검출기를 사용해야 합니다.RQ+는 시료관의 형광 발광기의 발광 강도와 소광기의 발광 강도의 비율을 나타내고, RQ-는 blank tube에서 두 개의 발광 강도의 비율을 나타내며, △RQ(△RQ=RQ+-RQ-)는 PCR 시 형광 신호 변화량을 나타내며 데이터 처리 후 정량적 결과를 얻을 수 있다.형광 프로브의 도입으로 인해 실험의 특이성이 크게 향상되었습니다.프로브 디자인은 일반적으로 다음과 같은 조건을 만족해야 합니다. ① 프로브의 길이는 바인딩 특이성을 보장하기 위해 약 20-40 염기가 되어야 합니다.② GC염기의 함량은 단일염기서열의 중복을 피하기 위해 40~60%로 한다.③ Primer와의 혼성화 또는 중복을 피한다.④ 프로브와 주형 간의 결합 안정성이 프라이머와 주형 간의 결합 안정성보다 크기 때문에 프로브의 Tm 값은 프라이머의 Tm 값보다 최소 5°C 이상 높아야 합니다.또한, 프로브의 농도, 프로브와 주형 서열 사이의 상동성, 프로브와 프라이머 사이의 거리 모두가 실험 결과에 영향을 미칩니다.

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