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설명

이 키트는 RT-qPCR 반응을 위해 배양된 세포 샘플에서 RNA를 빠르게 방출할 수 있는 고유한 용해 버퍼 시스템을 사용하므로 시간이 많이 걸리고 힘든 RNA 정제 프로세스가 필요하지 않습니다.단 7분만에 RNA 템플릿을 얻을 수 있습니다.키트에서 제공하는 5×Direct RT Mix 및 2×Direct qPCR Mix-SYBR 시약은 실시간 정량 PCR 결과를 빠르고 효과적으로 얻을 수 있습니다.

5×Direct RT Mix 및 2×Direct qPCR Mix-SYBR은 강한 inhibitor tolerance를 가지며 샘플의 lysate는 RT-qPCR의 주형으로 직접 사용할 수 있습니다.이 키트에는 고유한 RNA 고친화성 Foregene 역전사효소와 Hot D-Taq DNA 중합효소, dNTPs, MgCl이 포함되어 있습니다.₂, 반응 버퍼, PCR 최적화 및 안정제.

명세서

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

키트 구성품

기능 및 장점

■ 간단하고 효과적임 : Cell Direct RT 기술로 단 7분만에 RNA 샘플을 얻을 수 있습니다.

■ 샘플 수요가 적고 10개 셀까지만 테스트할 수 있습니다.

■ 높은 처리량: 384, 96, 24, 12, 6웰 플레이트에서 배양된 세포에서 RNA를 빠르게 검출할 수 있습니다.

■ DNA Eraser는 방출된 게놈을 신속하게 제거하여 후속 실험 결과에 미치는 영향을 크게 줄입니다.

■ 최적화된 RT 및 qPCR 시스템은 2단계 RT-PCR 역전사를 보다 효율적으로 만들고 PCR을 보다 특이적으로 만들고 RT-qPCR 반응 억제제에 대한 저항성을 높입니다.

키트 적용

적용 범위: 배양 세포.

- 샘플 용해에 의해 방출된 RNA: 이 키트의 RT-qPCR 템플릿에만 적용됩니다.

- 본 키트는 유전자 발현 분석, siRNA 매개 유전자 침묵 효과 검증, 약물 스크리닝 등의 용도로 사용할 수 있습니다.

도표

보관 및 유효 기간

이 키트의 Part I은 4℃에서 보관해야 합니다.Part II는 -20℃에서 보관해야 합니다.

Foregene Protease Plus II는 4℃에서 보관해야 하며 -20℃에서 동결하지 마십시오.

Reagent 2×Direct qPCR Mix-SYBR은 어두운 곳에서 -20℃에 보관해야 합니다.자주 사용하는 경우 단기간 보관(10일 이내 소진)을 위해 4℃에서 보관할 수도 있습니다. 우리는 경험이 풍부한 제조업체입니다.큰 할인 중국 고감도 원스텝 프로브 Rt-Qpcr 키트 V2에 대한 시장의 중요한 인증에서 대다수를 획득, 품질은 공장의 수명입니다. 고객의 요구에 초점은 회사 생존과 발전의 원천입니다.
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QuickE아시TM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

카탈로그 번호 DRT-01021/01022

1000,000개 이하의 세포를 사용하는 세포 직접 RT-qPCR의 경우

제품 소개

이 제품은 독자적인 lysis buffer system을 사용하여 RT-qPCR 반응을 위해 배양된 세포 샘플에서 RNA를 빠르게 방출하여 시간과 노력이 많이 드는 RNA 정제 과정을 생략하고 필요한 RNA 템플릿을 7분만에 얻을 수 있으며, 키트에서 제공하는 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman을 사용하면 빠르고 효율적으로 실시간 정량 PCR 결과를 얻을 수 있습니다.

5× Direct RT Mix와 2× Direct qPCR Mix-Taqman은 inhibitor tolerance가 강하여 측정하고자 하는 시료의 lysate를 template로 하여 효율적인 reversal과 specific amplification을 할 수 있습니다.시약에는 Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer 및 Stabilizer는 lysis Buffer와 함께 사용하여 시료를 빠르고 쉽게 검출할 수 있으며 높은 감도, 특이성 및 안정성의 특성을 가지고 있습니다.

제품 특징

RNA 샘플을 얻는 데 7분밖에 걸리지 않는 간단하고 효과적인 Cell Direct RT 기술.

샘플 요구 사항이 적고 최소 10개의 배양 세포를 실험에 사용할 수 있습니다.

384, 96, 24, 12 및 6웰 플레이트와 같은 배양 세포의 빠른 RNA 수집을 위한 높은 처리량.

DNA Eraser는 방출된 게놈을 신속하게 제거하여 후속 실험 결과에 미치는 영향을 크게 줄일 수 있습니다.

최적화된 RT 및 qPCR 시스템은 보다 효율적인 역전사, 특이성 및 보다 강력한 RT-qPCR 반응 억제제 내성으로 2단계 RT-PCR을 가능하게 합니다.

키트 적용

적용 범위: 배양 세포.

샘플 용해 해석 RNA: 2단계 RT-qPCR 템플릿으로만 사용됩니다.

키트는 유전자 조절 발현 분석, 대립 유전자 검사, 약물 스크리닝 등의 용도로 사용할 수 있습니다.

키트 제한 사항

증폭 단편 ≤ 300bp.

키트는 세포를 새로 배양하는 데 사용됩니다.

제품 품질 관리

FOREGENE의 Total Quality Management System에 따르면 Cell Direct RT-qPCR 시리즈 키트의 각 배치는 키트의 각 배치 품질의 신뢰성과 안정성을 보장하기 위해 여러 번 엄격하게 테스트됩니다.

키트 내용물

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman은 별도로 구매할 수 있으며 자세한 내용은 부록 1(PAGE 13)을 참조하십시오.

보관 조건

1. 배송 조건

키트가 <4 °C 상태인지 확인하기 위해 저온 아이스 팩 상자 운송의 전체 프로세스.

2. 보관조건

파트 I은 4°C에, 파트 II는 -20°C에 보관하십시오.

Foregene Protease Plus II는 -20°C에서 냉동하지 않고 4°C에서 보관해야 합니다.

Reagent 2× Direct qPCR Mix-Taqman은 -20°C에서 보관하거나 자주 사용하는 경우(10일 이내) 단기간 사용하려면 4°C에서 보관합니다.

키트 구성품 정보

Buffer CL: 세포 용해 반응에 필요한 환경을 제공합니다.

버퍼 ST: 후속 RT에 대한 영향을 피하기 위해 용해물에서 활성 물질을 종료합니다.

DNA 지우개: DNA 제거제, 후속 실험에서 게놈을 제거하는 효과.

5× Direct RT Mix: RNA 친화도가 높은 Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, dNTP, 안정제, 인핸서, 최적화제 및 최적 정렬을 위한 역전사 프라이머 포함(Random Primer, Oligo(dT)₁₈뇌관).

Foregene Protease Plus II: 용해 완충액과 관련하여 세포가 용해되어 핵산을 방출합니다.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: 이 시약에는 Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl이 포함되어 있습니다.₂, 반응 버퍼, PCR 최적화 및 안정제.

20× ROX Reference Dye: 일반적으로 ABI, Stratagene 등의 Real Time PCR 증폭 장비에 사용되며, PCR 투약 오류로 인한 PCR 튜브와 튜브의 차이를 조정하는 데 사용됩니다.기기마다 필요한 20× ROX Reference Dye 농도가 다르며 사용자는 기기의 권장 농도에 따라 추가할 수 있습니다.

RNase 프리 ddH₂O: 2단계 RT-qPCR 반응을 위한 RNase-free 멸균 초순수.

지침:(키트 사용 전 주의사항을 반드시 숙지하시기 바랍니다.)

시료 간의 교차 오염을 피하기 위해 실험의 조작 방법에 주의하십시오.

RNase 오염 및 RNA 분해를 방지하기 위해 실험 환경 및 기구의 청결에 주의하십시오.

신선하거나 잘 보존된 세포 샘플을 채취하고 동결-해동된 세포 샘플을 반복해서 사용하지 마십시오.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman은 반복적인 동결-해동을 피해야 합니다. 그렇지 않으면 역전사 및 PCR 효율에 영향을 미칩니다.

프레파식료품~ 전에작업

이 키트를 사용하기 전에 지침을 주의 깊게 읽으십시오.Cell Direct RT-qPCR Kit는 간단하고 편리하며 빠르게 작동할 수 있으며 설명서에는 전체 키트에 대한 완전한 정보와 올바르게 사용하는 방법이 나와 있습니다.사용 전 필요한 실험 재료 및 장비를 준비하시기 바랍니다.

실험 재료 및 장비

◆ 배양 세포.

◆ 1.5ml 또는 2ml, RNase-/DNase-Free 원심분리 튜브, RNase-/DNase-Free 팁, 0.2ml 멸균 qPCR 튜브.

◆ qPCR 기계, 피펫, 탁상형 원심분리기(≥13,400×g) (실험적 필요에 따라) 등

안전

◆ 본 제품은 과학적 연구용으로 의약품, 임상, 식품, 미용 목적으로 사용하지 마십시오.

◆ 화학물질 사용 시 적절한 실험복, 장갑, 보호안경 등을 착용한다.

작업가이드

Cell Lysis 시스템, RT 시스템 및 qPCR 반응 솔루션 보충 팩은 부록 1(PAGE 13)에서 자세한 내용을 별도로 구매할 수 있습니다.

운영안내

A: 샘플 RNA 방출

1. 세포를 전처리했습니다: 세포 배양 플레이트를 차가운 PBS로 세척한 다음 세포를 용해합니다(10-10⁶), 10⁶ RNA 추출 및 정제를 위해서는 Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total(DE-03111) 또는 Animal Total RNA Isolation Kit(DE-03011)를 권장합니다.

1.1.부착 세포(예: 24-웰 플레이트)

1.1.1.각 웰의 세포 수를 결정하고 세포 수가 1 × 10⁵, 피펫을 사용하여 배양 접시에서 배양 배지를 제거합니다.

1.1.2.미리 냉각된 1 × PBS 200 μl를 각 웰에 추가합니다.반복적으로 피펫팅하지 말고 웰에서 PBS를 제거하십시오.플레이트를 기울이고 가능한 한 많은 PBS를 제거합니다.2단계로 진행합니다.

1.1.3.상이한 세포 배양 접시 또는 참조 번호 표 1-1의 세포 배양 접시에 세포 세척을 위해 미리 냉각된 1 × PBS를 첨가하였다.

표 1-1: 다양한 수의 세포에 대한 PBS 투여량

메모：확고한 부착 세포를 보장하기 위해，세척 시 많은 수의 세포 손실이 방지됩니다.

1.2.비다공성 플레이트에서 배양된 현탁 세포 또는 부착 세포

1.2.1.비-멀티 웰 플레이트에서 배양된 부착 세포(현탁 세포는 다음 단계 1.2.2부터 시작), 일반 세포 수집 방법에 따라 세포를 수집 및 분리하고 배양 플레이트 또는 원심분리기 튜브에 넣습니다.트립신화를 사용하는 경우 세포를 수집하고 잔류 트립신을 제거하기 위해 원심분리가 필요하며, PBS 재중단 세포를 개별 세포에 추가하여 세포를 분산시킵니다.

1.2.2.세포수를 카운트한 후, 1×10개의 세포를 분주한다.⁵ 하나는 튜브를 원심분리하고, 10분 동안 1000 × g에서 원심분리하여 세포를 수집합니다.

1.2.3.원심분리기 튜브에 200 μl PBS를 추가하고 반복적으로 피펫팅하지 말고 PBS를 직접 흡인합니다.2단계로 진행한다. (침전이 어렵고 세포를 다시 재현탁한 경우, 상층액을 버리고 10분 후에 1000×g 원심분리를 수행할 수 있으며, 세포 펠렛은 2단계로 진행한다.)

2. 세포 용해: 준비한 다음 표 1-2 용해 시스템에 따라 완충액 CL, 실온으로 평형화된 온도, DNA Eraser 및 Foregene Protease Plus II를 제거합니다. (용해 용액은 사용할 준비가 되었습니다.)

표 1-2: 분열 시스템 준비(참고: 얼음 준비에서)

3.(예시 24-well plate) 각 well에 cell lysis master mix 200 μl를 피펫으로 5~10회 반복 불어넣고 실온(20~25℃)에서 5분간 배양한다.

메모：기포 발생을 방지하기 위해 피펫팅 시 피펫 눈금을 200μl 이하로 조절하시기 바랍니다.용해 후 세포가 뿌옇게 보일 수 있으며 이는 정상입니다.

4. (예를 들어 24-웰 플레이트) 액체 20 μl에 Buffer ST (표 1-3에 기재된 양으로 첨가된 상이한 용해 시스템 Buffer ST)를 첨가하고, 피펫팅을 5-10회 반복하고, 실온(20-25℃)에서 2분 동안 배양하였다.

메모：피펫 팁은 표면 아래에 배치되어 용해물이 추가되었는지 확인합니다.，거품이 생기지 않도록 피펫팅 시 피펫 눈금을 200μl 이하로 조절하여 주십시오.

표 1-3：버퍼 ST 추가

5. 용해물은 후속 RT-qPCR 실험에 사용됩니다.후속 실험을 제때 할 수 없는 경우 얼음에 2시간 이상 보관하고 -20℃ 또는 -80℃(3개월 이내)에서 보관하십시오.

B: RT 시스템 준비

1. Direct RT Mix 5개를 꺼내어 얼음 수조에 놓고 자연스럽게 녹인 다음 나중에 사용할 수 있도록 부드럽게 섞습니다.RNase-Free ddH2O를 꺼내 녹이고 나중에 사용할 수 있도록 얼음 수조에 담습니다.아래 표 2-1에 따라 얼음에 반응 시스템을 준비합니다.

표 2-1: RT 반응 시스템의 준비

2. 시스템 조성 완료 후 아래 표 2-2 반응조건 RT 반응에서 부드럽게 혼합하고 잠시 원심분리한다.

표 2-2: RT 반응 조건 설정

3. 반응 완료 후 qPCR을 위해 반응 생성물을 얼음 위에 직접 올려놓고 -20℃ 또는 -80℃에 넣어 장기 보관한다.

참고: 정제되지 않은 템플릿을 사용하여 역전사 제품에 흰색 침전물이 나타날 수 있습니다.이는 정상적인 현상입니다.후속 실험을 위해 즉시 상층액을 원심분리합니다.

생성된 RT 반응 용액은 다음 단계 Real Time PCR 반응 시스템에 추가되며, 반응 시스템의 10-30% 범위의 양을 추가하는 것이 좋습니다.

C: qPCR 반응 시스템 준비

1. 다음 표 3-1에 따라 cDNA template 단계에서 준비한 B를 적당량 준비하여 reaction system을 준비한다.

참고: cDNA 템플릿의 양은 qPCR 시스템의 10-30%를 차지합니다.예를 들어, 20μl qPCR 시스템에서 2-6 μl의 용해 버퍼를 추가하지만 6 μl 이하입니다.

2. qPCR 반응을 위한 최적의 qPCR 조건(Annealing 온도 등)(반응 조건은 표 3-2 참조).

참고: 더 나은 결과를 얻으려면 qPCR 반응에 최적화된 조건을 사용하십시오.

표 3-1: PCR 반응 시스템의 준비

1*: 프라이머 반응 성능이 좋지 않은 경우 프라이머 농도를 50-900 nM 범위에서 조정할 수 있습니다.

참고: qPCR 시스템은 실험 요구 및 형광 사이클러 모델에 따라 조정할 수 있습니다.50에서 qPCR의 경우μl 시스템, 20에 따라 시약 투여량을 비례적으로 조정μ내가 시스템.

2*: 형광 정량 열순환기에 따라 ROX Reference Dye의 적절한 최종 농도를 선택합니다.일반적인 형광 정량 순환기에 가장 적합한 ROX 참조 염료 농도는 아래 표에 나와 있습니다.

표 3-2: qPCR 반응 조건 제공

참고: 최상의 qPCR 효과를 얻기 위해 기울기 PCR을 사용하여 다양한 템플릿과 다양한 프라이머에 대한 반응 조건을 최적화할 수 있습니다.PCR 반응 조건은 형광 분석기, template, primer 등에 따라 다양합니다. 특정 작업에서는 형광 정량 Thermal Cycler의 특정 조건, Template 종류, 관심 단편의 크기, 증폭 단편의 염기서열 및 GC 함량, primer의 길이, annealing 온도, 반응 시간 등에 따라 최적의 반응 조건을 설계해야 합니다.

Real Time PCR 프라이머 설계 원리

정방향 프라이머 및 역방향 프라이머

Real Time PCR을 위해서는 프라이머 디자인이 매우 중요합니다.프라이머는 PCR 증폭의 특이성 및 효율성과 관련이 있으며 다음 원칙을 참조하여 설계할 수 있습니다.

◆ 프라이머 길이: 18-30bp.

◆ GC 함량: 40-60%.

◆ Tm 값: Primer 5와 같은 프라이머 디자인 소프트웨어는 프라이머의 Tm 값을 제공할 수 있습니다.업스트림 및 다운스트림 프라이머의 Tm 값은 가능한 한 가까워야 합니다.Tm 계산 공식도 사용할 수 있습니다. Tm = 4°C(G + C) + 2°C(A + T).PCR을 수행할 때 일반적으로 5°C의 프라이머 Tm 값 미만의 온도를 어닐링 온도로 선택합니다(어닐링 온도의 해당 증가는 PCR 반응의 특이성을 증가시킬 수 있음).

◆ 프라이머 및 PCR 제품:

◆ Design primer PCR amplification product length는 100-150bp가 바람직합니다.

◆ 템플릿의 2차 구조 영역에 있는 디자인 프라이머는 가능한 한 피해야 합니다.

◆ 업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머의 3' 말단 사이에 2개 이상의 상보적인 염기가 형성되지 않도록 합니다.

◆ Primer 3' 터미널 베이스는 3개의 추가 연속 G 또는 C와 함께 존재할 수 없습니다.

◆ 프라이머 자체는 상보적인 구조를 가질 수 없으며 그렇지 않으면 헤어핀 구조가 형성되어 PCR 증폭에 영향을 미칩니다.

◆ ATCG는 primer sequence에 최대한 고르게 분포되어야 하며, 3' 말단 염기는 T로 피해야 합니다.

부록1：C엘다이렉트RT-정량 PCR 키트 구성품t 보충 팩

1.세포용해액