센트럴 도그마에서 RNA는 DNA와 단백질 발현 사이의 전사 매개체라는 것은 잘 알려져 있습니다.DNA 검출과 비교하여 RNA 검출은 유기체의 유전자 발현을 보다 객관적으로 반영할 수 있습니다.RNA와 관련된 실험에는 qRT-PCR, RNA-Seq 및 융합 유전자 검출 등이 포함됩니다. RNA 자체의 특성(RNA의 당 고리는 DNA의 당 고리보다 하나 더 많은 자유 수산기 그룹을 가짐)에 따라 환경에서 많은 수의 RNase와 결합하여 RNA는 DNA보다 더 불안정하고 분해되기 쉽습니다.Garbage in, garbage out, RNA의 품질이 좋지 않으면 실험 결과가 만족스럽지 못하며 특히 부정확한 데이터 또는 불량한 반복성으로 나타납니다.따라서 RNA 처리에 더 많은 관심을 기울여야 하며, 후속 실험 데이터의 정확성과 정확성을 보장하기 위해 품질 관리의 연결도 더 중요합니다.

RNA의 품질 관리를 위해 일반적으로 다음과 같은 일반적으로 사용되는 방법이 있습니다.

• 분광광도법
• 아가로스 겔 전기영동
• 애질런트 생체분석기
• 실시간 형광 정량 PCR
• Qubit 형광염료법

01 분광광도법

RNA는 공액 이중 결합을 가지고 있으며 260nm의 파장에서 흡수 피크를 갖습니다.Lambert-Beer의 법칙에 따라 260nm에서 흡수 피크로부터 RNA 농도를 계산할 수 있습니다.또한 260nm, 280nm 및 230nm 흡수 피크의 비율에 따라 RNA의 순도를 계산할 수도 있습니다.280nm와 230nm는 각각 단백질과 작은 분자의 흡수 피크입니다.적격 RNA 순도의 A260/A280과 A260/A230의 비율은 2보다 커야 합니다. 2 미만이면 RNA 샘플에 단백질 또는 저분자 오염이 있음을 의미하며 다시 정제해야 합니다.오염원은 PCR 반응의 증폭 효율을 억제하는 등 후속 실험에 영향을 미쳐 부정확한 정량 결과를 초래합니다.RNA의 순도는 후속 결과에 큰 영향을 미치므로 분광광도법은 일반적으로 핵산 실험의 첫 번째 단계에서 필수적인 품질 관리 링크입니다.

그림 1. 일반적인 RNA/DNA 흡수 스펙트럼

02 Agarose gel 전기영동

순도 외에도 RNA의 무결성은 RNA의 품질을 판단하는 중요한 지표 중 하나입니다.RNA의 분해는 샘플에서 많은 수의 짧은 단편으로 이어질 것이므로 참조 서열에 의해 효과적으로 검출되고 커버될 수 있는 RNA 단편의 수가 감소할 것입니다.RNA 무결성은 1% 아가로스 젤에서 전체 RNA를 전기영동하여 확인할 수 있습니다.이 방법은 젤을 직접 구성하거나 무결성 테스트를 위해 조립식 E-Gel™ 시스템을 사용할 수 있습니다.총 RNA의 80% 이상이 리보솜 RNA이며, 대부분은 28S 및 18S rRNA(포유류 시스템에서)로 구성됩니다.양질의 RNA는 5Kb 및 2Kb에서 각각 28S 및 18S 밝은 막대인 두 개의 분명한 밝은 막대를 표시하며 비율은 2:1에 가까운 경향이 있습니다.확산된 상태라면 RNA 샘플이 분해되었을 수 있음을 의미하며, RNA의 품질을 추가로 테스트하기 위해 후술하는 방법을 사용하는 것이 좋습니다.

그림 2. 아가로스 겔 전기영동에서 분해된 RNA(레인 2)와 손상되지 않은 RNA(레인 3)의 비교

03 애질런트 생체분석기

RNA의 무결성을 간단하고 신속하게 식별하는 데 도움이 되는 위에서 설명한 아가로스 겔 전기영동 방법 외에도 애질런트 바이오분석기를 사용하여 RNA의 무결성을 확인할 수 있습니다.그것은 미세유체, 모세관 전기영동 및 형광의 조합을 사용하여 RNA 농도와 무결성을 평가합니다.Agilent bioanalyzer는 내장된 알고리즘을 사용하여 RNA 샘플의 프로필을 분석함으로써 참조 RNA 무결성 값인 RNA 무결성 번호(이하 RIN이라고 함)를 계산할 수 있습니다[1].RIN의 값이 클수록 RNA의 무결성이 높아집니다(1은 극도로 저하됨, 10은 가장 완전함).RNA와 관련된 일부 실험에서는 품질 평가를 위한 매개변수로 RIN을 사용할 것을 제안합니다.High-throughput sequencing 실험(이하 NGS)을 예로 들어, Thermo Fisher의 Oncomine 패널 시리즈에서 B 세포 및 T 세포 항원 수용체를 검출하는 데 사용되는 Oncomine™ Human Immune Repertoire의 가이드라인에서는 RIN 값이 4보다 큰 시료를 보다 효과적으로 판독하고 클론을 측정할 수 있다고 제안합니다(그림 3).패널마다 권장 범위가 다르며 종종 RIN이 높을수록 더 효과적인 데이터를 가져올 수 있습니다.

그림 3, Oncomine™ Human Immune Repertoire 실험에서 RIN이 4보다 큰 샘플은 더 효과적인 판독 및 T 세포 클론을 검출할 수 있습니다.【2】

그러나 RIN 값에도 몇 가지 제한이 있습니다.RIN은 NGS 실험 데이터의 품질과 상관관계가 높지만 FFPE 샘플에는 적합하지 않습니다.FFPE 샘플은 오랫동안 화학적으로 처리되어 추출된 RNA는 일반적으로 RIN 값이 상대적으로 낮습니다.그러나 이것이 실험의 유효 데이터가 만족스럽지 않다는 것을 의미하지는 않습니다.FFPE 샘플의 품질을 정확하게 평가하려면 RIN 이외의 측정을 사용해야 합니다.Agilent bioanalyzer는 RIN 외에도 RNA 품질의 평가 매개변수로 DV200 값을 계산할 수 있습니다.DV200은 RNA 샘플에서 200bp보다 큰 단편의 비율을 계산하는 매개변수입니다.DV200은 RIN보다 FFPE 샘플 품질을 더 잘 나타내는 지표입니다.FFPE로 추출한 RNA의 경우 효과적으로 검출할 수 있는 유전자의 수와 유전자의 다양성과 매우 높은 상관관계를 갖는다[3].DV200은 FFPE의 품질 검출 결함을 보완할 수 있지만 Agilent bioanalyzer는 여전히 샘플에 억제제가 있는지 여부를 포함하여 RNA 샘플의 품질 문제를 포괄적으로 분석할 수 없습니다.억제제 자체는 다운스트림 실험의 증폭 효율에 영향을 미치고 유용한 데이터의 양을 줄일 수 있습니다.샘플에 억제제가 있는지 여부를 알기 위해 다음에 설명하는 실시간 형광 정량 PCR 방법을 채택할 수 있습니다.

04 실시간 형광 정량 PCR

실시간 형광 정량 PCR 방법은 샘플의 억제제를 검출할 수 있을 뿐만 아니라 FFPE 샘플의 RNA 품질을 정확하게 반영합니다.Agilent 생물학적 분석기와 비교할 때 실시간 형광 정량 기기는 더 넓은 응용 분야로 인해 주요 생물학 실험실에서 더 많이 사용됩니다.RNA 샘플의 품질을 테스트하려면 GUSB(Cat no. Hs00939627)와 같은 내부 참조 유전자용 프라이머 프로브만 구입하거나 준비하면 됩니다.이 프라이머, 프로브 및 표준 세트(알려진 농도의 총 RNA)를 사용하여 절대 정량 실험을 수행함으로써 유효 RNA 단편 농도를 RNA 품질의 평가 표준으로 계산할 수 있습니다(줄여서 Functional RNA Quantitation(FRQ)).NGS 테스트에서 RNA 샘플의 FRQ가 유효 데이터 볼륨과 매우 높은 상관 관계가 있음을 발견했습니다.0.2ng/uL FRQ보다 큰 모든 샘플의 경우 판독값의 최소 70%가 참조 시퀀스를 효과적으로 커버할 수 있습니다(그림 4).

그림 4에서 형광 정량법으로 검출한 FRQ 값은 NGS 실험에서 얻은 유효 데이터와 매우 높은 상관관계(R2>0.9)를 보였다.빨간색 선은 0.2ng/uL(log10 = -0.7)에 해당하는 FRQ 값입니다.【4】

실시간 정량 PCR 방법은 FFPE 샘플에 적용할 수 있을 뿐만 아니라 샘플의 억제제를 효과적으로 모니터링할 수 있습니다.내부 양성 대조군(Internal Positive Control, IPC)과 그 Assay를 사용하여 검출할 샘플을 반응 시스템에 추가한 다음 형광 정량을 수행하여 Ct 값을 얻을 수 있습니다.샘플이 없는 반응에서 Ct 값이 Ct 값보다 뒤처지면 샘플에 억제제가 존재하고 반응에서 증폭 효율을 억제함을 나타냅니다.

05 Qubit 형광염색법

Qubit Fluorometer는 핵산 농도 및 순도 검출을 위해 가장 일반적으로 사용되는 소형 장치로 작동이 쉽고 거의 모든 분자 생물학 실험실에 존재합니다.핵산과 결합하는 형광염료(Qubit 검출시약)를 검출하여 핵산의 농도를 정확하게 계산합니다.Qubit은 감도와 특이성이 높으며 RNA를 pg/µL 농도까지 정확하게 정량화할 수 있습니다.핵산 농도를 정확하게 정량화하는 잘 알려진 기능 외에도 Thermo Fisher의 최신 새 모델인 Qubit 4.0은 RNA의 무결성도 감지할 수 있습니다.Qubit 4.0의 RNA 검출 시스템(RNA IQ 분석)은 두 가지 특정 형광 염료를 동시에 검출하여 RNA의 무결성을 검출합니다.이 두 가지 형광 염료는 각각 RNA의 큰 조각과 작은 조각에 결합할 수 있습니다.이 두 가지 형광 염료는 샘플에서 RNA의 큰 조각의 비율을 나타내며 이로부터 RNA 품질을 나타내는 IQ(Integrity and Quality) 값을 계산할 수 있습니다.IQ 값은 FFPE 및 non-FFPE 샘플 모두에 적용 가능하며 후속 시퀀싱 품질에 큰 영향을 미칩니다.NGS 실험을 예로 들면, Ion torrent™ 플랫폼에서 수행된 RNA-Seq 테스트 실험에서 IQ 값이 4보다 큰 대부분의 샘플은 최소 50%의 유효 판독을 보였습니다(그림 5).위에서 언급한 검출 방법과 비교할 때 Qubit IQ Assay는 작동이 더 편리하고 시간이 덜 소요될 뿐만 아니라(5분 이내) 측정된 매개변수 IQ 값과 후속 실험의 데이터 품질 사이에 큰 상관 관계가 있습니다.

그림 5에서 Qubit RNA IQ 값과 RNA-Seq의 매핑된 판독 사이에는 큰 상관관계가 있습니다.【5】

위의 소개를 통해 모든 사람이 다양한 RNA 품질 관리 방법에 대해 충분히 이해하고 있다고 생각합니다.실제로는 선택할 수 있습니다.샘플 유형 및 기존 기기에 따라 해당 방법.RNA의 품질을 잘 제어해야만 샘플 품질 저하로 인한 후속 실험의 실패를 피할 수 있으므로 귀중한 시간, 에너지 및 비용을 절약할 수 있습니다.

참조 제품:

동물 총 RNA 분리 키트

세포 총 RNA 분리 키트

참조

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: RNA 측정에 무결성 값을 할당하기 위한 RNA 무결성 번호입니다.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi.org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine Human Immune Repertoire 사용자 가이드(Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA Derived From Archival Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Samples, Toxicological Sciences, Volume 170, Issue 2, 2019년 8월, 페이지 357–373,https://doi.org/10.1093/toxsci/